[發(fā)明專利]結(jié)合生物基質(zhì)膠生成hiPSC-RPE細胞膜片的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210084503.6
• 申請日: 2022-01-25
• 公開（公告）號: CN114540302A
• 公開（公告）日: 2022-05-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李桂蘭;劉奕志;鄭穎豐
• 申請（專利權(quán)）人: 中山大學(xué)中山眼科中心
• 主分類號: C12N5/079
• 分類號: C12N5/079;C12N5/074
• 代理公司: 北京翔石知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11816
• 代理人: 李勇

1.一種結(jié)合生物基質(zhì)膠生成hiPSC-RPE細胞膜片的方法，其特征在于，包括：

步驟S1，將預(yù)處理后的豬眼葡萄膜制備脫細胞基質(zhì)膠；

步驟S2，維持培養(yǎng)hiPSCs；

步驟S3，培養(yǎng)hiPSC-RPE懸浮球；

步驟S4，hiPSC-RPE細胞擴增培養(yǎng)；

步驟S5,生成hiPSC-RPE細胞膜片；

其中，所述步驟S5中，將濃度為1％的Uvea-Gel包被培養(yǎng)皿，于37℃放置30min左右，待Uvea-Gel凝固，形成一層薄薄的膜樣區(qū)域為BM膜，用以模擬天然BM微環(huán)境。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)合生物基質(zhì)膠生成hiPSC-RPE細胞膜片的方法，其特征在于，所述步驟S1中，預(yù)處理后的豬眼葡萄膜經(jīng)兩輪浸泡后冷凍干燥形成脫細胞基質(zhì)粉末，脫細胞基質(zhì)粉末用胃蛋白酶酶解后，與0.1N氫氧化鈉溶液中和形成脫細胞基質(zhì)膠。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的結(jié)合生物基質(zhì)膠生成hiPSC-RPE細胞膜片的方法，其特征在于，第一輪浸泡依次采用5％Triton X-100浸泡4h，5％SDS浸泡4h，4M尿素浸泡4h，用去離子水浸泡1.5h，第二輪浸泡依次采用1％Triton X-100浸泡3h，PBS洗15min，1％Triton X-100浸泡18h。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的結(jié)合生物基質(zhì)膠生成hiPSC-RPE細胞膜片的方法，其特征在于，在所述步驟S2中，將hiPSCs接種于脫細胞基質(zhì)膠包被的培養(yǎng)板，于mTeSR1(Stem Cell)培養(yǎng)基中維持培養(yǎng)4-5天，選取克隆密度長至約80％-90％底面積時進行傳代。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)合生物基質(zhì)膠生成hiPSC-RPE細胞膜片的方法，其特征在于，在所述步驟S3中，將維持培養(yǎng)后的hiPSCs采用0.5mM的EDTA消化為小細胞團，向小細胞團內(nèi)加入含有10μM的Blebbistatin的培養(yǎng)液，并將其轉(zhuǎn)移至低吸附皿中，于37℃培養(yǎng)過夜，24h后可見EBs形成，將形成的EBs連續(xù)保持懸浮培養(yǎng)6天后誘導(dǎo)分化，其中，EBs培養(yǎng)第一天培養(yǎng)液替換為25％NIM和75％mTeSR1，EBs培養(yǎng)第二天培養(yǎng)液替換為50％NIM和50％mTeSR1，EBs培養(yǎng)第三天，將EBs轉(zhuǎn)移到到含有NIM培養(yǎng)液培養(yǎng)3天，EBs培養(yǎng)第6-7天，將EBs重新接種在用脫細胞基質(zhì)膠包被的培養(yǎng)皿中，開始貼壁培養(yǎng)誘導(dǎo)分化，誘導(dǎo)分化25天，富集形成RPE球。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的結(jié)合生物基質(zhì)膠生成hiPSC-RPE細胞膜片的方法，其特征在于，所述誘導(dǎo)分化后形成的3D視網(wǎng)膜誘導(dǎo)分化的視杯樣結(jié)構(gòu)為典型六邊形結(jié)構(gòu)，且色素化。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的結(jié)合生物基質(zhì)膠生成hiPSC-RPE細胞膜片的方法，其特征在于，在所述步驟S4中，將富集的RPE球懸浮培養(yǎng)8周后分成若干小塊，將小塊RPE球于37℃條件下，用dispase II孵育5-10min，解離成單細胞懸液，將單細胞懸液接種在0.1％的Uvea-Gel包被的培養(yǎng)板中進行擴增。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的結(jié)合生物基質(zhì)膠生成hiPSC-RPE細胞膜片的方法，其特征在于，所述單細胞懸液擴增初期選用血清培養(yǎng)基，后期選用無血清培養(yǎng)基促進hiPSC-RPE分化成熟。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)合生物基質(zhì)膠生成hiPSC-RPE細胞膜片的方法，其特征在于，在所述步驟S5中，單細胞hiPSC-RPE接種至BM膜上，進行增殖和分化，hiPSC-RPE細胞生長4-6周后可形成含色素并且緊密連接的RPE片。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的結(jié)合生物基質(zhì)膠生成hiPSC-RPE細胞膜片的方法，其特征在于，將形成的Uvea-Gel/hiPSC-RPE細胞膜片分割為任意大小，通過dispase II孵育3-5min后，將hiPSC-RPE細胞膜片脫離基質(zhì)膠層，形成hiPSC-RPE細胞膜片。