[發明專利]一種胺脫氫酶突變體及其在手性胺醇化合物合成中的應用

在審

• 申請號: 202210082158.2
• 申請日: 2022-01-24
• 公開（公告）號: CN116515782A
• 公開（公告）日: 2023-08-01
• 發明（設計）人: 孫周通;曲戈;明輝
• 申請（專利權）人: 中國科學院天津工業生物技術研究所
• 主分類號: C12N9/06
• 分類號: C12N9/06;C12N15/53;C12N15/70;C12N1/21;C12P13/00;C12P41/00;C12R1/19
• 代理公司: 北京知文通達知識產權代理事務所(普通合伙) 16051
• 代理人: 歐陽石文

本發明公開了胺脫氫酶突變體及其在手性胺醇化合物合成中的應用。本發明公開的胺脫氫酶突變體，為對來源于嗜熱脂肪地芽孢桿菌(Geobacillus?stearothermophilus)的胺脫氫酶（GsLDH）進行突變得到的蛋白質。本發明的胺脫氫酶突變體可以催化羥基酮底物合成以4?羥基?2?丁酮為代表的手性胺醇化合物，操作方便，具有產物光學純度高等優點，立體選擇性可高達99%，在生物催化制備手性胺醇化合物具有較好的工業應用前景。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，涉及胺脫氫酶突變體及其在手性胺醇化合物中的應用。

背景技術

手性胺醇是合成許多重要藥物的前體，被用來合成多種具有生物活性的化合物。其中(R)-3-氨基-1-丁醇是一種含有手性胺基團重要的手性藥物中間體，在有機合成和制藥領域應用非常廣泛，可以用來合成抗腫瘤藥物、抗艾滋病藥物以及β-內酰胺衍生物。

目前，(R)-3-氨基-1-丁醇的合成主要通過化學法。已有文獻報道，以手性(R)-丙氨酸為原料，經氨基保護后，重氮甲烷增長碳鏈變為β-氨基酸酯，脫保護后還原得到目標產物。該方法的缺點是高手性純度的(R)-丙氨酸較難得到，重氮甲烷使用危險，不適合規?；I化生產。以巴豆酸酯與(R)-(+)-α-苯乙胺為底物進行反應生成具有兩個手性中心的一組差向異構體，通過硅膠柱層析分離后得到單一的異構體，然后經過酯還原、脫芐基得到(R)-3-氨基-1-丁醇。該路線步驟較少，原料易得，但是存在反應選擇性較差，分離純化困難，還原劑價格昂貴，因此不適合規?；a。以3-丁酸乙酯為原料，經生物還原法得到3-(S)-丁酸乙酯，并在其后的反應步驟中在Witsunobu試劑催化下與酞酰亞胺反應，發生Walden轉化，成功的把3-(S)構型改變為所需要的3-(R)構型中間體，并得到最終目的標物。但是，冗長的合成路線，使用比較昂貴的Witsunobu試劑和價格既貴又具危險性的四氫鋁鋰等眾多因素使其難以實現產業化。

綜上所述，化學法合成(R)-3-氨基丁醇存在原料短缺，成本高，高溫高壓反應條件，污染環境，安全性低，

因此，尋找綠色方法來合成手性胺醇，尤其是(R)-3-氨基-1-丁醇，對促進現有化學工藝的綠色升級和加強對環境的保護具有重要的工業應用價值。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是如何高效制備手性胺醇化合物。

為解決以上技術問題，本發明首先提供了一種胺脫氫酶突變體(也稱為GsAmDH突變蛋白質)，在SEQ?ID?NO：1所示氨基酸序列的第43、68、114、134、146、187、261、291、294位存在替換突變。其中野生型的胺脫氫酶來源于嗜熱脂肪地芽孢桿菌(Geobacillusstearothermophilus)，其是uniprot：P13154(GsLDH)，而SEQ?ID?No.1所示氨基酸序列是在所述野生型序列上進行K68S和D261L兩個位點突變獲得的(稱為GsAmDH)。任選地還可以增加有標簽序列，如增加組氨酸標簽等便于操作。

所述突變胺脫氫酶是SEQ?ID?No.1所示氨基酸序列上存在選自如下九種的任一種、任兩種、任三種、任四種、任五種、任六種、任七種、任八種或全部突變得到的蛋白質：

X1、將GsAmDH第43位的蘇氨酸殘基突變為甲硫氨酸殘基；

X2、將GsAmDH第68位的賴氨酸殘基突變為絲氨酸殘基；

X3、將GsAmDH第114位的谷氨酸殘基突變為纈氨酸殘基、半胱氨酸殘基或亮氨酸殘基；

X4、將GsAmDH第134位的蘇氨酸殘基突變為甘氨酸殘基或半胱氨酸殘基；

X5、將GsAmDH第146位的脯氨酸殘基突變為纈氨酸殘基；

X6、將GsAmDH第187位的組氨酸殘基突變為天冬氨酸殘基；