[發(fā)明專(zhuān)利]一種基于銅離子響應(yīng)焦磷酸根的堿性磷酸酶或甲胎蛋白檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210076454.1
• 申請(qǐng)日: 2022-01-24
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN114441758B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-09-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 于麗;臺(tái)文君;宓靜如;吳達(dá);劉金鵬
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 山東大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): G01N33/574
• 分類(lèi)號(hào): G01N33/574;G01N33/58;C12Q1/42
• 代理公司: 濟(jì)南金迪知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 37219
• 代理人: 陳桂玲

本發(fā)明涉及一種基于銅離子響應(yīng)焦磷酸根的堿性磷酸酶或甲胎蛋白檢測(cè)方法。包括步驟如下：(1)制備海藻酸銅水凝膠和焦磷酸鈉溶液；(2)制備梯度濃度的堿性磷酸酶標(biāo)準(zhǔn)溶液和甲胎蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液；(3)繪制堿性磷酸酶標(biāo)準(zhǔn)曲線；(4)繪制甲胎蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線；(5)檢測(cè)待測(cè)樣品中堿性磷酸酶和甲胎蛋白的含量。本發(fā)明提供的基于銅離子響應(yīng)焦磷酸根的堿性磷酸酶或甲胎蛋白檢測(cè)方法，具有操作過(guò)程簡(jiǎn)單，成本低，試劑消耗少等優(yōu)點(diǎn)，堿性磷酸酶的檢測(cè)限為1.7mU/mL，甲胎蛋白的定量檢測(cè)限為0.8ng/mL，有效地解決了現(xiàn)有檢測(cè)方法復(fù)雜、成本高的問(wèn)題，為臨床診斷和應(yīng)用提供了發(fā)展前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明提供了一種基于銅離子響應(yīng)焦磷酸根的堿性磷酸酶或甲胎蛋白檢測(cè)方法，屬于檢測(cè)分析技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

堿性磷酸酶(ALP)是廣泛分布在動(dòng)物體內(nèi)最重要的水解酶之一，它能催化生物分子去磷酸化，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等細(xì)胞周期過(guò)程。在臨床診斷中，ALP作為重要的生物標(biāo)記物可指示多種疾病，例如糖尿病，骨骼疾病，前列腺癌和肝功能異常等。此外，ALP由于其催化活性高、穩(wěn)定性好、底物特異性廣、易于與抗體結(jié)合等特點(diǎn)，被廣泛用于酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)中作為標(biāo)記酶。標(biāo)記酶的高特異性抗原-抗體識(shí)別和高效的生物催化特性使ELISA已經(jīng)成為臨床診斷、食品質(zhì)量控制、環(huán)境監(jiān)測(cè)和實(shí)驗(yàn)室研究中最廣泛使用的免疫分析形式。

甲胎蛋白(AFP)是一種糖蛋白，它屬于白蛋白家族，主要由胎兒肝細(xì)胞及卵黃囊合成。甲胎蛋白在胎兒血液循環(huán)中具有較高的濃度，出生后則下降，至生后2～3月甲胎蛋白基本被白蛋白替代，血液中較難檢出，故在成人血清中含量極低。甲胎蛋白具有很多重要的生理功能，包括運(yùn)輸功能、作為生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子的雙向調(diào)節(jié)功能、免疫抑制、T淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡等。甲胎蛋白與肝癌及多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，在多種腫瘤中均可表現(xiàn)出較高濃度，可作為多種腫瘤的陽(yáng)性檢測(cè)指標(biāo)。目前臨床上主要作為原發(fā)性肝癌的血清標(biāo)志物，用于原發(fā)性肝癌的診斷及療效監(jiān)測(cè)。一般情況下，健康成人的AFP濃度低于25ng/mL，而肝癌的病理變化值可能會(huì)超過(guò)400ng/mL。

因此，對(duì)AFP的臨床分子診斷顯得十分重要，目前已報(bào)道的測(cè)定AFP免疫檢測(cè)方法有熒光免疫法、電化學(xué)免疫法、化學(xué)發(fā)光免疫法和放射免疫法，盡管這些方法對(duì)靈敏檢測(cè)生物標(biāo)志物做出了巨大貢獻(xiàn)，但必須提供和獲得復(fù)雜的儀器和熟練的專(zhuān)業(yè)操作人員。因此，迫切需要開(kāi)發(fā)一種技術(shù)簡(jiǎn)單、綠色、方便的免疫分析方法。即時(shí)診斷(POCT)技術(shù)產(chǎn)品降低了對(duì)配套設(shè)備和操作專(zhuān)業(yè)性的要求，可用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)和疾病前期篩查診斷，可應(yīng)用到基層醫(yī)療單位或在資源有限的偏遠(yuǎn)地區(qū)實(shí)現(xiàn)患者在家中實(shí)現(xiàn)自檢。紙張具有天然的網(wǎng)狀多孔結(jié)構(gòu)，因而其比表面積較高，有助于分析物的擴(kuò)散以及材料的固定化，大大縮短了分析時(shí)間。紙張資源豐富且成本很低，易于通過(guò)簡(jiǎn)單的加工技術(shù)進(jìn)行批量化的生產(chǎn)，柔性可折疊的紙張更易于形成雙層甚至3D構(gòu)架的流體通道同時(shí)連接實(shí)現(xiàn)靈活的流體控制。此外，紙張可燃且生物相容性好，避免環(huán)境污染，輕薄柔性，利于運(yùn)輸。并且紙基不需要憑借其它的外力僅通過(guò)紙本身的毛細(xì)管作用便可以實(shí)現(xiàn)流體的運(yùn)輸。

綜上所述，開(kāi)發(fā)一種利用紙基，能夠簡(jiǎn)單快速、靈敏檢測(cè)堿性磷酸酶(ALP)和甲胎蛋白(AFP)濃度的分析方法在臨床研討中起著重要的研究意義。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種基于銅離子響應(yīng)焦磷酸根的堿性磷酸酶或甲胎蛋白檢測(cè)方法。在無(wú)需復(fù)雜的儀器和操作程序的情況下，實(shí)現(xiàn)對(duì)堿性磷酸酶以及腫瘤標(biāo)志物甲胎蛋白的即時(shí)檢測(cè)。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種基于銅離子響應(yīng)焦磷酸根的堿性磷酸酶或甲胎蛋白檢測(cè)方法，包括步驟如下：

(1)向海藻酸鹽溶液中添加銅離子溶液，混合均勻，得到海藻酸銅水凝膠；將焦磷酸鈉溶于HEPES緩沖溶液中，得到焦磷酸鈉溶液；

(2)將堿性磷酸酶標(biāo)準(zhǔn)品溶解于HEPES緩沖液中，得到梯度濃度的堿性磷酸酶標(biāo)準(zhǔn)溶液；將甲胎蛋白母液用PBS緩沖溶液稀釋?zhuān)玫教荻葷舛鹊募滋サ鞍讟?biāo)準(zhǔn)溶液；