[發(fā)明專利]非洲綠猴腎細胞的全懸浮細胞株及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210075921.9
• 申請日: 2022-01-23
• 公開（公告）號: CN114317414B
• 公開（公告）日: 2023-08-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 韓偉;黃書林;周建民;潘京學
• 申請（專利權(quán)）人: 中牧實業(yè)股份有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N5/02;C12N7/00;C12N7/02;A61K39/12;A61P31/14;C12R1/91
• 代理公司: 北京惟誠致遠知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11536
• 代理人: 王慧鳳

本發(fā)明公開了非洲綠猴腎細胞的全懸浮細胞株及其應(yīng)用。本發(fā)明的非洲綠猴腎細胞的全懸浮細胞株已于2021年10月26日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC?No.23098。本發(fā)明采用非洲綠猴腎細胞的全懸浮細胞株生產(chǎn)豬乙型腦炎病毒抗原，較傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝、較大的簡化了生產(chǎn)工藝，降低了生產(chǎn)成本。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及獸用生物制品領(lǐng)域，尤其涉及非洲綠猴腎細胞的全懸浮細胞株及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

乙型腦炎又稱日本腦炎(Japanese?encephalitis，JE)，簡稱乙型腦炎，是由乙型腦炎病毒(Japanese?encephalitis?Virus，JEV)引起的一種人畜共患傳染病，我國將豬乙型腦炎歸為二類動物疫病，豬乙型腦炎病毒歸為第三類動物病原微生物。本病經(jīng)由蚊蟲媒介而傳播，有嚴格的季節(jié)性，流行于6～10月，集中于7、8、9三個月。同時蚊蟲也是本病毒的長期儲存宿主，豬為最主要的增殖宿主和傳染源，人群中以兒童感染發(fā)病率較高。動物感染發(fā)病癥狀表現(xiàn)為發(fā)病急，高溫高熱，流產(chǎn)，死胎，病死率較高。在該病流行期間，豬對乙型腦炎病毒感染率幾乎可達100％，但很多時候處于隱形感染狀態(tài)，成為人乙型腦炎感染的主要來源。

目前，已有4種不同類型的JEV疫苗：鼠腦滅活疫苗、細胞培養(yǎng)滅活疫苗、細胞培養(yǎng)減毒活疫苗和基因工程減毒活疫苗。獸用乙型腦炎疫苗主要為鼠腦滅活疫苗和地鼠腎細胞乙型腦炎活疫苗。現(xiàn)有的豬乙型腦炎疫苗均存在一定的問題，如由鼠腦制備的疫苗存在成本高、雜蛋白多和易導致過敏反應(yīng)等弊端，地鼠腎細胞活疫苗存在成本高，操作復(fù)雜，批間存在差異等弊端。

Vero細胞來源于非洲綠猴腎傳代細胞，其優(yōu)點是易于大規(guī)模培養(yǎng)，胞核學穩(wěn)定，無外源因子污染，無致瘤性，是WHO推薦使用的人用疫苗生產(chǎn)基質(zhì)，適用于大規(guī)模疫苗生產(chǎn)用的細胞源。此外，國內(nèi)商品化豬乙型腦炎疫苗均采用傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)方式，存在細胞易污染、勞動強度大等缺點。與轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝相比，反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)采用無血清培養(yǎng)，獲得的細胞密度、病毒效價、產(chǎn)品質(zhì)量均明顯提高，無血清性外源病毒污染，生產(chǎn)能耗大幅降低。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種非洲綠猴腎細胞的全懸浮細胞株。

本發(fā)明所提供的非洲綠猴腎細胞的全懸浮細胞株，命名為Vero-zm，已于2021年10月26日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNo.23098。

本發(fā)明的的非洲綠猴腎細胞的全懸浮細胞株可用于病毒生產(chǎn)中，還可以用于生產(chǎn)疫苗中。

本發(fā)明的另一個目的是提供一種制備豬乙型腦炎病毒抗原的方法。

本發(fā)明所提供的制備豬乙型腦炎病毒抗原的方法，包括：

采用非洲綠猴腎細胞的全懸浮細胞株生產(chǎn)豬乙型腦炎病毒；

收獲所述豬乙型腦炎病毒液，添加硫酸魚精蛋白，經(jīng)離心、過濾、濃縮、分子篩凝膠層析，得到豬乙型腦炎病毒抗原。

其中，所述非洲綠猴腎細胞的全懸浮細胞株在V-SFM培養(yǎng)基上進行復(fù)蘇和擴大培養(yǎng)。

其中，所述硫酸魚精蛋白的終濃度1-2mg/ml。

其中，所述豬乙型腦炎病毒為豬乙型腦炎病毒SA14-14-2。

其中，在采用所述非洲綠猴腎細胞的全懸浮細胞株生產(chǎn)豬乙型腦炎病毒中，所述病毒接種后孵育階段的生物反應(yīng)器的參數(shù)為：溫度36～37℃，pH值7.2±0.1，溶氧40～60％，攪拌速度40～80rpm，通氣量0.1～0.5SPLM。

其中，在采用所述非洲綠猴腎細胞的全懸浮細胞株生產(chǎn)豬乙型腦炎病毒中，所述病毒孵育后的培養(yǎng)階段的生物反應(yīng)器的參數(shù)為：溫度33～35℃，pH值7.4～7.8，溶氧40～60％，攪拌速度80～120rpm，通氣量0.1～0.5SPLM。