[發明專利]非洲綠猴腎細胞的全懸浮細胞株及其應用有效

申請號：	202210075921.9	申請日：	2022-01-23
公開（公告）號：	CN114317414B	公開（公告）日：	2023-08-08
發明（設計）人：	韓偉;黃書林;周建民;潘京學	申請（專利權）人：	中牧實業股份有限公司
主分類號：	C12N5/071	分類號：	C12N5/071;C12N5/02;C12N7/00;C12N7/02;A61K39/12;A61P31/14;C12R1/91
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摘要：
搜索關鍵詞：	非洲綠猴腎細胞懸浮細胞株及其應用
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【說明書】：

本發明公開了非洲綠猴腎細胞的全懸浮細胞株及其應用。本發明的非洲綠猴腎細胞的全懸浮細胞株已于2021年10月26日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC?No.23098。本發明采用非洲綠猴腎細胞的全懸浮細胞株生產豬乙型腦炎病毒抗原，較傳統轉瓶培養工藝、較大的簡化了生產工藝，降低了生產成本。

技術領域

本發明涉及獸用生物制品領域，尤其涉及非洲綠猴腎細胞的全懸浮細胞株及其應用。

背景技術

乙型腦炎又稱日本腦炎(Japanese?encephalitis，JE)，簡稱乙型腦炎，是由乙型腦炎病毒(Japanese?encephalitis?Virus，JEV)引起的一種人畜共患傳染病，我國將豬乙型腦炎歸為二類動物疫病，豬乙型腦炎病毒歸為第三類動物病原微生物。本病經由蚊蟲媒介而傳播，有嚴格的季節性，流行于6～10月，集中于7、8、9三個月。同時蚊蟲也是本病毒的長期儲存宿主，豬為最主要的增殖宿主和傳染源，人群中以兒童感染發病率較高。動物感染發病癥狀表現為發病急，高溫高熱，流產，死胎，病死率較高。在該病流行期間，豬對乙型腦炎病毒感染率幾乎可達100％，但很多時候處于隱形感染狀態，成為人乙型腦炎感染的主要來源。

目前，已有4種不同類型的JEV疫苗：鼠腦滅活疫苗、細胞培養滅活疫苗、細胞培養減毒活疫苗和基因工程減毒活疫苗。獸用乙型腦炎疫苗主要為鼠腦滅活疫苗和地鼠腎細胞乙型腦炎活疫苗。現有的豬乙型腦炎疫苗均存在一定的問題，如由鼠腦制備的疫苗存在成本高、雜蛋白多和易導致過敏反應等弊端，地鼠腎細胞活疫苗存在成本高，操作復雜，批間存在差異等弊端。

Vero細胞來源于非洲綠猴腎傳代細胞，其優點是易于大規模培養，胞核學穩定，無外源因子污染，無致瘤性，是WHO推薦使用的人用疫苗生產基質，適用于大規模疫苗生產用的細胞源。此外，國內商品化豬乙型腦炎疫苗均采用傳統轉瓶培養方式，存在細胞易污染、勞動強度大等缺點。與轉瓶培養工藝相比，反應器懸浮培養采用無血清培養，獲得的細胞密度、病毒效價、產品質量均明顯提高，無血清性外源病毒污染，生產能耗大幅降低。

發明內容

本發明的目的在于提供一種非洲綠猴腎細胞的全懸浮細胞株。

本發明所提供的非洲綠猴腎細胞的全懸浮細胞株，命名為Vero-zm，已于2021年10月26日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNo.23098。

本發明的的非洲綠猴腎細胞的全懸浮細胞株可用于病毒生產中，還可以用于生產疫苗中。

本發明的另一個目的是提供一種制備豬乙型腦炎病毒抗原的方法。

本發明所提供的制備豬乙型腦炎病毒抗原的方法，包括：

采用非洲綠猴腎細胞的全懸浮細胞株生產豬乙型腦炎病毒；

收獲所述豬乙型腦炎病毒液，添加硫酸魚精蛋白，經離心、過濾、濃縮、分子篩凝膠層析，得到豬乙型腦炎病毒抗原。

其中，所述非洲綠猴腎細胞的全懸浮細胞株在V-SFM培養基上進行復蘇和擴大培養。

其中，所述硫酸魚精蛋白的終濃度1-2mg/ml。

其中，所述豬乙型腦炎病毒為豬乙型腦炎病毒SA14-14-2。

其中，在采用所述非洲綠猴腎細胞的全懸浮細胞株生產豬乙型腦炎病毒中，所述病毒接種后孵育階段的生物反應器的參數為：溫度36～37℃，pH值7.2±0.1，溶氧40～60％，攪拌速度40～80rpm，通氣量0.1～0.5SPLM。