[發明專利]新型冠狀病毒多種變異株核酸質譜檢測的引物組合、試劑盒及檢測方法

在審

• 申請號: 202210074264.6
• 申請日: 2022-01-21
• 公開（公告）號: CN114686620A
• 公開（公告）日: 2022-07-01
• 發明（設計）人: 翟志向;周曉光;宋合興;李晨;李運濤
• 申請（專利權）人: 生物島實驗室;廣東默迪優譜生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京智信四方知識產權代理有限公司 11519
• 代理人: 葛啟宏

本發明公開了新型冠狀病毒多種變異株核酸質譜檢測的引物組合、試劑盒及檢測方法，涉及分子生物學檢測技術領域。其中，包括16條擴增引物和9條質量探針延伸引物，通過多重PCR技術與MALDI?TOF技術聯用，能夠實現在對新型冠狀病毒進行檢測的同時，還能進一步對多種變異株進行分型鑒定。檢測通量高，更適合于大規模的新冠病毒病例篩查。

技術領域

本發明涉及分子生物學檢測技術領域。更具體地，涉及一種新型冠狀病毒多種變異株 核酸質譜檢測的引物組合、試劑盒及檢測方法。

背景技術

對于新冠病毒的核酸檢測，目前的主要方法是熒光定量RT-PCR方法。由于熒光通道的 限制，一次只能對新冠病毒進行N，ORF1ab的兩個靶標進行檢測，不能進行有效分型，尤 其在低病毒載量條件下，容易出現單陽性，假陰性的情況。NGS高通量測序也是對新冠病毒檢測的一種重要技術，通過全測序可以實現病毒及亞型的準確鑒定，但是整體流程時間長，不能快速給出病毒檢測結果；而且實驗操作復雜，樣本檢測成本高。而在疫情大面積爆發時，能夠對感染者或攜帶者快速準確檢測診斷對于疫情防控具有至關重要的作用及意義， 因此，迫切需要一種特異性高、靈敏度高、高通量且操作相對簡單的低成本的檢測方法來對 新冠病毒變異株進行檢測鑒定與進一步分型。

發明內容

本發明的一個目的在于提供一種用于新型冠狀病毒多種變異株核酸質譜檢測的引物 組合及包含這些引物組合的檢測試劑盒，提高對新型冠狀病毒的篩查診斷能力。

本發明的另一個目的在于提供一種利用上述試劑盒進行新型冠狀病毒多種變異株核 酸質譜檢測的方法。該方法使得新型冠狀病毒檢測特異性強，靈敏度高。

為達到上述目的，本發明采用下述技術方案：

第一方面，本發明提供一種用于新型冠狀病毒多種變異株核酸質譜檢測的引物組合， 包括16條擴增引物和9條質量探針延伸引物，其中，擴增引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.1-16所示，具體見表1；質量探針延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID No.17-25所示，具 體見表2。

表1擴增引物序列

表2質量探針延伸(MPE)引物序列

本發明將多重PCR技術與MALDI-TOF質譜技術相結合，即采用PCR-微測序進行 新型冠狀病毒核酸檢測以及多個變異株的分型檢測。在本發明中，通過對新型冠狀病毒多 種變異株進行序列分析，針對選定的檢測靶基因和特異性突變位點，設計了一系列檢測新 型冠狀病毒變異毒株的PCR擴增引物和質量探針延伸(MPE)引物。其中，本發明選擇新 型冠狀病毒基因N，ORF1ab，S-D614G作為通用靶標基因，以至少兩個基因檢出作為新 型冠狀病毒陽性判斷標準；同時選擇新型冠狀病毒多種變異株的特異性突變位點作為分型 檢測靶標，實現對新型冠狀病毒變異株的分型檢測，本發明還設置了內參基因人RNaseP， 大大提高檢測靈敏度，并可實現短時間內高通量檢測，更適合應用于大規模的病毒疑似病 例的檢測篩查。

本發明還提供了上述引物組合在制備新型冠狀病毒多種變異株核酸質譜檢測產品中 的應用。

根據本發明的具體實施方式，本發明提供一種新型冠狀病毒多種變異株核酸質譜檢測 試劑盒，該試劑盒包括上述引物組合。

進一步的，所述試劑盒還包括RT-PCR反應試劑、去磷酸化反應試劑及質量探針延伸 反應試劑。

第二方面，本發明提供一種新型冠狀病毒多種變異株核酸質譜檢測方法，該方法使用 上述試劑盒，具體包括：