[發明專利]一種紅米稻血紅素結合蛋白的原核細胞高效表達方法

在審

• 申請號: 202210072817.4
• 申請日: 2022-01-21
• 公開（公告）號: CN114230652A
• 公開（公告）日: 2022-03-25
• 發明（設計）人: 方慶;黃卉;王海洋
• 申請（專利權）人: 湖北民族大學
• 主分類號: C07K14/415
• 分類號: C07K14/415;C12N15/70;C12N15/29;C12N15/66
• 代理公司: 北京金智普華知識產權代理有限公司 11401
• 代理人: 張曉博

1.一種紅米稻血紅素結合蛋白的原核細胞高效表達方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟一、植物材料準備，對紅米稻進行無菌消毒，置于培養皿無菌濾紙上保持一定濕度，進行培養箱培養，待萌發2-4d后作為紅米稻幼苗樣品；

步驟二、紅米稻總RNA提取，取少量無菌紅米稻幼苗樣品，采用Trizol法提取紅米稻總RNA；

步驟三、RT-PCR擴增目的基因，設計目的基因OsHBP2上、下游引物，上下游引物分別設計限制性核酸內切酶位點為BamH1和EcoR1，以反轉錄產物單鏈cDNA為模板擴增目的基因；

步驟四、目的基因與重組表達載體連接，對上述擴增產物進行乙醇沉淀回收，取回收產物和pColdⅠ載體分別進行限制性核酸內切酶消化，形成粘性末端，回收酶切表達載體及目的基因片段進行連接反應；

步驟五、重組載體轉化大腸桿菌細胞，取連接體系中產物5μl，與大腸桿菌感受態細胞進行混合，冰浴20-40min后進行熱激轉化，復蘇菌液涂濃度為100ug/ml的LB+Amp培養基，倒置平皿培養10-20h，觀察并挑選單菌落進入液體LB培養，提取質粒和測序鑒定克隆子；

步驟六、目的蛋白大腸桿菌誘導表達與檢測，將測序正確的重組質粒導入表達菌株BL21感受態細胞中，進行0.1mM IPTG誘導，誘導表達1-5h，超聲破碎細胞，離心分離裂解菌后的上清，與鎳瓊脂糖凝膠珠進行親和結合，再進行咪唑溶液洗脫，對分次洗脫的樣品收集，并制備電泳樣品后進行SDS-PAGE凝膠電泳分析。

2.根據權利要求1所述的一種紅米稻血紅素結合蛋白的原核細胞高效表達方法，其特征在于：所述步驟一中對紅米稻進行無菌消毒方法為使用2％次氯酸鈉溶液消毒5min，無菌水反復沖洗4次。

3.根據權利要求1所述的一種紅米稻血紅素結合蛋白的原核細胞高效表達方法，其特征在于，所述步驟二中采用Trizol法提取紅米稻總RNA的具體操作為：

取少量無菌紅米稻幼苗樣品置于預冷的研缽中，液氮研磨成粉末，加入Trizol抽提緩沖液，浸潤后轉入EP管中，上下顛倒2min，靜置1min后加入氯仿200ul，用力震蕩15秒混勻，靜置3分鐘后，12000rpm離心10分鐘，吸取上清至新的ep管，加入500μl異丙醇，顛倒混勻，靜置8min后，12000rpm離心10分鐘；75％乙醇洗滌沉淀并晾干，用RNase-free ddH2O溶解并低溫貯存樣品。

4.根據權利要求1所述的一種紅米稻血紅素結合蛋白的原核細胞高效表達方法，其特征在于：

所述步驟三中上游引物為：OsHBP2-F CGGGATCCATGGGGATGGTGCTGGGCA；

下游引物為：OsHBP2-R CGGAATTCTCACTCGACGGGGACCAT。

5.根據權利要求1所述的一種紅米稻血紅素結合蛋白的原核細胞高效表達方法，其特征在于：所述步驟三中包括PCR反應程序，PCR反應程序為95℃3min，95℃30s，50℃30s，72℃45s，72℃5min，16℃10min，反應循環數設為30。

6.根據權利要求1所述的一種紅米稻血紅素結合蛋白的原核細胞高效表達方法，其特征在于：所述步驟四中，基因片段和pColdⅠ載體酶切反應體系為：載體或基因片段Ⅰ3.0μl，BamHⅠ1.0μl，EcoR1 1.0μl，10×H buffer 5.0μl，ddH2O(含RNase)40μl；將上述成分輕輕混勻后，37℃保溫4小時，再回收酶切表達載體及目的基因片段進行連接反應，體系為DNA1.0μl，ddH2O 4.5μl，pCold I 0.5μl，Solution 0.5μl；16℃連接10小時。

7.根據權利要求1所述的一種紅米稻血紅素結合蛋白的原核細胞高效表達方法，其特征在于：所述步驟六中超聲破碎細胞的破碎功率為66W，時間4～10s，重復3次，間隔10s。