[發(fā)明專利]一種紅米稻血紅素結(jié)合蛋白的原核細(xì)胞高效表達(dá)方法

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• 申請日: 2022-01-21
• 公開（公告）號(hào): CN114230652A
• 公開（公告）日: 2022-03-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 方慶;黃卉;王海洋
• 申請（專利權(quán)）人: 湖北民族大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K14/415
• 分類號(hào): C07K14/415;C12N15/70;C12N15/29;C12N15/66
• 代理公司: 北京金智普華知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11401
• 代理人: 張曉博

本發(fā)明公開了一種紅米稻血紅素結(jié)合蛋白的原核細(xì)胞高效表達(dá)方法，涉及原核細(xì)胞表達(dá)技術(shù)領(lǐng)域，包括以下步驟：植物材料準(zhǔn)備，對(duì)紅米稻進(jìn)行無菌消毒，進(jìn)行培養(yǎng)箱培養(yǎng)，取少量無菌紅米稻幼苗樣品，采用Trizol法提取紅米稻總RNA；RT?PCR擴(kuò)增目的基因，目的基因與重組表達(dá)載體連接，重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞，目的蛋白大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)與檢測，本發(fā)明采用現(xiàn)代基因工程策略，通過對(duì)紅米稻總RNA提取、RT?PCR擴(kuò)增目的基因。將目的基因與重組表達(dá)載體連接，再重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)紅米稻中一個(gè)血紅素結(jié)合相關(guān)的目的蛋白基因在原核細(xì)胞大腸桿菌中高效表達(dá)，為該類型植物源性血紅素結(jié)合相關(guān)蛋白的大量獲得及其活性鑒別和運(yùn)用提供了關(guān)鍵技術(shù)條件和基礎(chǔ)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及原核細(xì)胞表達(dá)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種紅米稻血紅素結(jié)合蛋白的原核細(xì)胞高效表達(dá)方法。

背景技術(shù)

血紅素是四吡咯化合物(tetrapyrroles)家族的重要成員之一。隨研究深入，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)人類和哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)血紅素的功能重要且多樣。其不僅作為血紅蛋白重要的輔基，而且參與氧的代謝與轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞內(nèi)電子轉(zhuǎn)移等調(diào)節(jié)。多數(shù)情況下體內(nèi)非游離的血紅素往往和蛋白亞基相互作用形成復(fù)合物，發(fā)揮其調(diào)節(jié)功能。但是，游離血紅素過多卻可誘發(fā)產(chǎn)生活性氧進(jìn)而造成細(xì)胞氧化應(yīng)激損害。因此，細(xì)胞內(nèi)血紅素須受酶或特定蛋白等作用調(diào)節(jié)以維持相對(duì)穩(wěn)定。血紅素結(jié)合相關(guān)蛋白(heme binding-related proteins，HBP)，包括血紅素氧合酶等是參與血紅素調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因子。植物血紅素較難溶于水分，需要借助其輔基蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到功能組織部位。因此，植物來源性血紅素輔基蛋白，包括血紅素結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)血紅素正常發(fā)揮功能具有重要作用。水稻是我國第一大糧食作物，而有色稻是我國重要的稻米種資源。比如，紅米作為我國古老而珍貴的稻種資源，因其糙米皮具有紅色沉淀而得名，是藥食同源的滋補(bǔ)珍品。新形勢下，運(yùn)用生物技術(shù)方法發(fā)現(xiàn)內(nèi)源活性蛋白因子對(duì)于深入開發(fā)紅米稻遺傳資源、促進(jìn)其資源利用具有重要意義。例如，加強(qiáng)資源性稻米中的血紅素結(jié)合相關(guān)蛋白或酶的基因研究，鑒定其表達(dá)產(chǎn)物生物活性，將可為進(jìn)一步開發(fā)和運(yùn)用其有益于人體營養(yǎng)和健康方面的功能提供基礎(chǔ)。

植物源性的血紅素結(jié)合相關(guān)蛋白基因在植物體內(nèi)對(duì)于增強(qiáng)植物抵抗生物和非生物脅迫方面具有重要潛能。其很可能借助抗氧化途徑發(fā)揮功能。但目前對(duì)紅米稻中的血紅素結(jié)合相關(guān)蛋白研究很少，其體外有益活性待深入發(fā)掘。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種紅米稻血紅素結(jié)合蛋白的原核細(xì)胞高效表達(dá)方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)中的上述不足之處。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：一種紅米稻血紅素結(jié)合蛋白的原核細(xì)胞高效表達(dá)方法，包括以下步驟：

步驟一、植物材料準(zhǔn)備，對(duì)紅米稻進(jìn)行無菌消毒，置于培養(yǎng)皿無菌濾紙上保持一定濕度，進(jìn)行培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待萌發(fā)2-4d后作為紅米稻幼苗樣品；

步驟二、紅米稻總RNA提取，取少量無菌紅米稻幼苗樣品，采用Trizol法提取紅米稻總RNA；

步驟三、RT-PCR擴(kuò)增目的基因，設(shè)計(jì)目的基因OsHBP2上、下游引物，上下游引物分別設(shè)計(jì)限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)為BamH1和EcoR1，以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物單鏈cDNA為模板擴(kuò)增目的基因；

步驟四、目的基因與重組表達(dá)載體連接，對(duì)上述擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行乙醇沉淀回收，取回收產(chǎn)物和pColdⅠ載體分別進(jìn)行限制性核酸內(nèi)切酶消化，形成粘性末端，回收酶切表達(dá)載體及目的基因片段進(jìn)行連接反應(yīng)；

步驟五、重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞，取連接體系中產(chǎn)物5μl，與大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行混合，冰浴20-40min后進(jìn)行熱激轉(zhuǎn)化，復(fù)蘇菌液涂濃度為100ug/ml的LB+Amp培養(yǎng)基，倒置平皿培養(yǎng)16h，觀察并挑選單菌落進(jìn)入液體LB培養(yǎng)，提取質(zhì)粒和測序鑒定克隆子；