[發明專利]一株來源于溶藻弧菌噬菌體的裂解酶及其應用

在審

• 申請號: 202210070046.5
• 申請日: 2022-01-20
• 公開（公告）號: CN114426980A
• 公開（公告）日: 2022-05-03
• 發明（設計）人: 趙哲;李席席;喻飛;張策;史燕;魏富成;吳穎
• 申請（專利權）人: 河海大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N1/21;C12N15/56;C12N15/55;A01N63/50;A01P1/00;C12R1/19
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 王艷

本發明公開了噬菌體的裂解酶基因holA和lysin的共表達載體、共表達載體的重組菌株、噬菌體共表達裂解酶holA?lysin及其制備方法及其應用，本發明通過PCR擴增等獲得噬菌體HH109的裂解酶基因holA和lysin，克隆至表達系統并轉入目標菌株以獲得重組菌。重組菌在IPTG誘導表達裂解酶基因，以實現對溶藻弧菌和大腸桿菌等菌的高效裂解，而且裂解作用沒有選擇性，表現出廣譜的應用范圍。提示了噬菌體HH109的裂解酶在防治溶藻弧菌等弧菌感染上具有潛在的應用價值。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一株來源于溶藻弧菌噬菌體的裂解酶及其應用。

背景技術

溶藻弧菌是水產養殖中重要的條件致病菌，對海水養殖業造成了極大的危害。此外，該弧菌也可引起人類的一些病癥，如造成五官和胃腸道的感染，引起中耳炎和食物中毒等。近年來，隨著水產養殖模式由粗放化向高密度集約化的快速轉變，導致病害頻發。使用抗生素及化學消毒劑等傳統的治療方法產生了諸多問題，例如細菌產生耐藥性、病原菌傳播引發安全問題、養殖水環境微生態失衡、人類生存環境遭受破壞等。這些問題進而由弧菌等細菌性病原引發的水生動物病害難以有效治療，成為制約水產養殖業可持續發展的一個關鍵性因素。因此，迫切需要尋找一種安全、有效的防控策略，以提高水產養殖成功率、水產品質量和安全性。

噬菌體廣泛存在于環境中，是以真菌、細菌等微生物為宿主的病毒，因具有特異性高、對人體無副作用等優點被廣泛關注，但是噬菌體作為一個獨立的生命體在用作抗菌制劑時會產生抗噬菌體菌株，且生物安全性一直受到質疑。噬菌體裂解酶是dsDNA噬菌體在感染細菌后期表達的一種水解酶。與噬菌體相比，裂解酶具有不易使細菌產生耐藥性、能殺死在黏膜表面定植病原菌、且宿主譜相對較廣等優點。因此，噬菌體裂解酶具有巨大的應用前景。

發明內容

發明目的：本發明所要解決的技術問題是提供了噬菌體的裂解酶基因holA和lysin的共表達載體。

本發明還要解決的技術問題是提供了含有所述的共表達載體的重組菌株。

本發明還要解決的技術問題是提供了噬菌體裂解酶holA-lysin及其制備方法。

本發明最后要解決的技術問題是提供了所述的共表達載體、所述的重組菌株、所述的噬菌體裂解酶holA-lysin在溶藻弧菌裂解中的應用。

本發明還提供了噬菌體共表達裂解酶holA-lysin對裂解大腸桿菌及不同來源的溶藻弧菌的裂解效果評價方法。

本發明的目的是通過尋找新的可抑制或殺死溶藻弧菌等水產病原弧菌的噬菌體裂解酶，以期減少和替代抗生素的使用。本發明利用生物技術手段在大腸桿菌和溶藻弧菌中共表達噬菌體HH109的裂解酶holA和lysin基因，證明它們的表達能夠高效地裂解大腸桿菌及溶藻弧菌，可作為潛在的新型生物制劑用于防治由病原菌溶藻弧菌引起的水生動物疾病。

技術方案：為了解決上述技術問題，本發明提供了噬菌體的裂解酶基因holA和lysin的共表達載體，所述共表達載體通過將噬菌體基因組DNA作為模板，分別以基因holA的引物對和基因lysin的引物對進行PCR擴增，得到基因holA片段和基因lysin片段，將基因holA片段和基因lysin片段融合，然后與載體連接即得。

其中，所述噬菌體為噬菌體HH109。

其中，所述基因holA的引物對包括上游引物holA-F1和下游引物holA-R1；或上游引物holA-F2和下游引物holA-R2；其中，所述上游引物holA-F1序列如SEQ ID NO：1所示，所述下游引物holA-R1序列如SEQ ID NO：2所示，所述上游引物holA-F2序列如SEQ ID NO：5所示，所述下游引物holA-R2序列如SEQ ID NO：6所示。