[發(fā)明專(zhuān)利]綿羊血液基因組DNA的提取方法及其應(yīng)用、綿羊資源群體的遺傳多樣性評(píng)價(jià)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210069549.0
• 申請(qǐng)日: 2018-04-23
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN114181934A
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-03-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周明亮;楊平貴;龐倩;陳明華;蔣世海
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 四川省草原科學(xué)研究院
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/10
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/10;C12Q1/6806;C12Q1/686;C12Q1/6888
• 代理公司: 北京方圓嘉禾知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11385
• 代理人: 戴嵩瑋

本發(fā)明涉及遺傳多樣性評(píng)價(jià)方法領(lǐng)域，尤其是綿羊資源群體的遺傳多樣性評(píng)價(jià)方法。包括以下步驟：a.采集綿羊的血液樣品；b.提取血液樣品的基因組DNA；c.在微衛(wèi)星標(biāo)記數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選30對(duì)微衛(wèi)星標(biāo)記引物，分布于綿羊26對(duì)常染色體和X性染色體，并通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證引物序列，微衛(wèi)星標(biāo)記采用5?ROX、5'6?FAM(FITC)、5?TAMRA和5?HEX進(jìn)行熒光標(biāo)記；d.PCR擴(kuò)增及微衛(wèi)星標(biāo)記的等位基因分型；e.統(tǒng)計(jì)分析及資源群體的遺傳多樣性評(píng)價(jià)。本發(fā)明全面而系統(tǒng)地分析與評(píng)價(jià)綿羊資源群體的遺傳多樣性，為綿羊資源群體的開(kāi)發(fā)與利用提供分子水平的理論依據(jù)，提高了評(píng)價(jià)的全面性，并節(jié)約了成本。

本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2018年04月23日、申請(qǐng)?zhí)枮?01810366963.1、發(fā)明名稱(chēng)為《綿羊資源群體的遺傳多樣性評(píng)價(jià)方法》的分案申請(qǐng)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及遺傳多樣性評(píng)價(jià)方法領(lǐng)域，尤其是綿羊血液基因組DNA的提取方法及其應(yīng)用、綿羊資源群體的遺傳多樣性評(píng)價(jià)方法。

背景技術(shù)

生物多樣性(biodiversity)是指地球上所有生物(動(dòng)物、植物、微生物等)、它們所包含的基因以及由這些生物與環(huán)境相互作用所構(gòu)成的生態(tài)系統(tǒng)的多樣化程度，包括物種多樣性、遺傳多樣性和生態(tài)系統(tǒng)多樣性。遺傳多樣性可以表現(xiàn)在多個(gè)層次上，如分子、細(xì)胞、個(gè)體等。在生物的長(zhǎng)期演化過(guò)程中，遺傳物質(zhì)的改變(或突變)是產(chǎn)生遺傳多樣性的根本原因，即染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)的變化及基因位點(diǎn)內(nèi)部的核苷酸的變化，在表型上表現(xiàn)出各種各樣的形態(tài)。遺傳多樣性是生物多樣性的重要組成部分，種內(nèi)個(gè)體間的差異是因生活環(huán)境的差異和經(jīng)歷長(zhǎng)時(shí)間的選擇、突變的結(jié)果，如果遺傳多樣性越高，則種群內(nèi)可提供環(huán)境選擇的基因就越多，對(duì)于環(huán)境的適應(yīng)能力就越強(qiáng)，有利于種群的生存和演化。

綿羊(Ovis aries)的資源群體是在一定的地域、環(huán)境和生態(tài)區(qū)域內(nèi)，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的自然選擇和人民群眾的人工選擇而逐步形成的具有一定生物學(xué)特性的群體。遺傳標(biāo)記常用于對(duì)動(dòng)植物群體的遺傳多樣性評(píng)價(jià)，形態(tài)標(biāo)記是最早使用的一種標(biāo)記，能夠用肉眼識(shí)別顯示出來(lái)的遺傳多樣性的外觀特征，如綿羊的體高、體長(zhǎng)、毛色等，早期的綿羊育種曾利用角的有無(wú)、被毛顏色等作為選擇的依據(jù)，但由于形態(tài)標(biāo)記數(shù)量少，受環(huán)境、生理時(shí)期的影響較大，在實(shí)際應(yīng)用中受到很大的限制。細(xì)胞學(xué)標(biāo)記是采用染色體的結(jié)構(gòu)和數(shù)量特征來(lái)顯示遺傳多態(tài)性，如染色體的核型、帶型以及數(shù)目等，隨著分子水平的發(fā)展和深入，逐漸取代了細(xì)胞學(xué)標(biāo)記。蛋白質(zhì)標(biāo)記有酶蛋白質(zhì)和非酶蛋白質(zhì)兩種，常用的有血紅蛋白多態(tài)性、運(yùn)鐵蛋白多態(tài)性等，一般根據(jù)標(biāo)記與表型的相關(guān)性，為選擇提供依據(jù)。與形態(tài)學(xué)標(biāo)記和細(xì)胞學(xué)標(biāo)記相比，蛋白質(zhì)標(biāo)記數(shù)量更豐富，受環(huán)境影響較小，能更好地反映遺傳多態(tài)性，但其最大的不足是數(shù)量比較有限，不能滿(mǎn)足進(jìn)一步的精確研究的需要，同時(shí)，也被反映基因組水平的DNA分子標(biāo)記所取代。

DNA分子標(biāo)記問(wèn)世以來(lái)，已發(fā)展了RFLP、RAPD、AFLP、SSR和SNP等10多種標(biāo)記。SSR標(biāo)記是一種具有高度多態(tài)性、豐富性、中性和共顯性等特性的理想標(biāo)記，常用于動(dòng)植物資源群體的遺傳多樣性的評(píng)價(jià)。一些研究者將微衛(wèi)星標(biāo)記用于綿羊群體的遺傳多樣性分析與評(píng)價(jià)，他們較多地應(yīng)用分布于綿羊1條染色體，幾條染色體或10多條染色體上的幾個(gè)或10多個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行群體的遺傳多樣性分析，表現(xiàn)出我國(guó)綿羊綿羊群體具有豐富的遺傳多樣性。

綜上所述，現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題是：1)形態(tài)學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記、蛋白質(zhì)標(biāo)記等標(biāo)記因其數(shù)量有限，不能全面反映群體的遺傳多樣性而被DNA分子技術(shù)所更替；2)微衛(wèi)星標(biāo)記用于群體遺傳多樣性的分析與評(píng)價(jià)，一般采用分布于1條染色體或幾條染色體上的幾個(gè)微衛(wèi)星或10多個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記來(lái)進(jìn)行分析，較少的研究者采用超過(guò)20個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記，但又不能覆蓋到每一條染色體上，未能從全基因組全面地評(píng)價(jià)群體的遺傳多樣性。3)SNP標(biāo)記用于群體遺傳多樣性分析，一般采用單個(gè)基因的SNP位點(diǎn)來(lái)進(jìn)行群體的遺傳多樣性分析，不足之處在于一次性分析的位點(diǎn)較少，每一個(gè)位點(diǎn)的等位基因僅有2個(gè)；另一方面，采用高通量技術(shù)掃描全基因組SNP位點(diǎn)，用于群體的遺傳多樣性分析的位點(diǎn)多，但成本貴。

發(fā)明內(nèi)容