[發(fā)明專利]綿羊血液基因組DNA的提取方法及其應用、綿羊資源群體的遺傳多樣性評價方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210069549.0
• 申請日: 2018-04-23
• 公開（公告）號: CN114181934A
• 公開（公告）日: 2022-03-15
• 發(fā)明（設計）人: 周明亮;楊平貴;龐倩;陳明華;蔣世海
• 申請（專利權(quán)）人: 四川省草原科學研究院
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/6806;C12Q1/686;C12Q1/6888
• 代理公司: 北京方圓嘉禾知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11385
• 代理人: 戴嵩瑋

1.一種提取綿羊血液基因組DNA的方法，其特征在于：包括以下步驟：

1)取綿羊血液200μL，加入到1.5mL的EP管中，加入20μL的蛋白酶K溶液后混勻，再加入200μL緩沖液GB，充分顛倒混勻，70℃水浴鍋中放置10min；

2)取出EP管，再加入200μL無水乙醇，充分振蕩混勻15s，將所得溶液轉(zhuǎn)移至吸附柱CB3中，12000rpm離心30s，倒掉收集管中廢液，向吸附柱CB3加入500μL的GD，12000rpm離心30s，倒掉收集管中廢液；

3)向吸附柱CB3加入600μL的漂洗液PW，12000rpm離心30s，倒掉收集管中廢液，重復一次向吸附柱CB3中加600μL的漂洗液PW、離心及倒掉廢液；

4)將吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm離心2min，倒掉廢液，將吸附柱CB3置于室溫數(shù)分鐘，再轉(zhuǎn)入一個新的EP管中，向吸附柱的中間部位懸空滴加洗脫緩沖液TE，室溫放置2～5min，12000rpm離心2min，EP管中的液體即為提取的DNA溶液，進行凝膠電泳檢測后置于-20℃環(huán)境下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.權(quán)利要求1所述方法得到的綿羊血液基因組DNA在評價綿羊資源群體的遺傳多樣性中的應用。

3.一種綿羊資源群體的遺傳多樣性評價方法，其特征在于：包括以下步驟：

采集綿羊的血液樣品；

利用權(quán)利要求1所述的方法提取血液樣品的基因組DNA；

在微衛(wèi)星標記數(shù)據(jù)庫中篩選30對微衛(wèi)星標記引物，分布于綿羊26對常染色體和X性染色體，并通過NCBI數(shù)據(jù)庫驗證引物序列，微衛(wèi)星標記采用5-ROX、5'6-FAM(FITC)、5-TAMRA和5-HEX進行熒光標記；

PCR擴增及微衛(wèi)星標記的等位基因分型；

統(tǒng)計分析及資源群體的遺傳多樣性評價，采用軟件分析微衛(wèi)星標記的雜合度和多態(tài)信息含量，按照衡量基因變異程度高低的多態(tài)信息含量指標，即PIC0.50的標記為高度多態(tài)信息位點，PIC0.25的標記為低度多態(tài)信息位點，0.25＜P＜0.50的標記為中度多態(tài)信息位點，綿羊群體30個微衛(wèi)星標記的遺傳多態(tài)信息含量為0.3338～0.8660，其中7個標記為中度多態(tài)信息位點，23個標記為高度多態(tài)信息位點，群體的平均多態(tài)信息含量為0.6257，來表明綿羊資源群體具有豐富的遺傳多態(tài)性。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的綿羊資源群體的遺傳多樣性評價方法，其特征在于：所述采集步驟為：采用頸靜脈采布拖黑綿羊的血3～4mL，注入加有抗凝劑肝素鈉的一次性真空采血管中，隨后將采血管180°顛倒混勻5-6次，置于低溫保存箱中運輸，帶回實驗室20°保存?zhèn)溆谩?/p>

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的綿羊資源群體的遺傳多樣性評價方法，其特征在于：所述PCR擴增及等位基因分型的步驟為：使用試劑盒，25μL反應體系：2×Taq PCR MasterMix 12.5μL，上、下游引物10mmol/L各1μL，DNA模板1μL，用超純水補充至25μL，94℃預變性5min，94℃變性30s，56℃-63℃退火30s，72℃延伸30s，共35個循環(huán)，最后72℃延伸8min，擴增產(chǎn)物8℃保存。

6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的綿羊資源群體的遺傳多樣性評價方法，其特征在于：所述軟件為Cervus3.0軟件。