[發(fā)明專利]一種磷酸膽堿胞苷酰轉(zhuǎn)移酶突變體及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210067168.9
• 申請日: 2022-01-20
• 公開（公告）號: CN114426959A
• 公開（公告）日: 2022-05-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 應(yīng)漢杰;繆榕新;溫慶仕;鄭誠;王駿之
• 申請（專利權(quán)）人: 鄭州大學(xué);南京工業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N9/12
• 分類號: C12N9/12;C12N15/54;C12N15/70;C12N1/21;C12P19/30;C12P7/64;C12P13/00;C12R1/19
• 代理公司: 江蘇圣典律師事務(wù)所 32237
• 代理人: 肖明芳

本發(fā)明基于NCBI序列號為NP_011718.1的野生型的磷酸胞苷膽堿酰轉(zhuǎn)移酶的氨基酸進(jìn)行改造，希望通過增加酸性氨基酸的數(shù)量，提高突變體的耐鹽性，意外篩選得到了3種高耐鹽性磷酸胞苷膽堿酰轉(zhuǎn)移酶突變體，改造后的磷酸膽堿胞甘酰轉(zhuǎn)移酶，相較于改造之前，具有更高的耐鹽性，發(fā)酵過程中能提高CDP?膽堿的產(chǎn)量，滿足工業(yè)生產(chǎn)需求。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程，具體涉及磷酸膽堿胞苷酰轉(zhuǎn)移酶突變體的制備及應(yīng)用。

背景技術(shù)

CDP-膽堿作為一種藥物已被廣泛用于治療腦血管和心血管疾病。工業(yè)生產(chǎn)CDP-膽堿曾使用的是化學(xué)合成的方法，但是由于其底物轉(zhuǎn)化率低、使用的試劑有毒性的等劣勢，并不適合大批量生產(chǎn)。

在胞苷二磷酸膽堿的生產(chǎn)過程中，隨著反應(yīng)進(jìn)行鹽濃度逐漸升高，當(dāng)鹽濃度超過1200mM時(shí)，反應(yīng)過程關(guān)鍵磷酸膽堿胞苷酰轉(zhuǎn)移酶(來自釀酒酵母S288C NP_011718.1)活性降低了75％～80％。這種抑制會阻礙這一工藝在工業(yè)中的應(yīng)用。因此，基于釀酒酵母S288C的NP_011718.1基因，構(gòu)建改造的高耐鹽性的磷酸膽堿胞苷酰轉(zhuǎn)移酶。

發(fā)明內(nèi)容

發(fā)明目的：為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題，本發(fā)明提供了改造的高耐鹽性的磷酸膽堿胞苷酰轉(zhuǎn)移酶的突變體。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明通過對NCBI序列號為NP_011718.1的磷酸膽堿胞苷酰轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行突變，得到若干種磷酸膽堿胞苷酰轉(zhuǎn)移酶突變體。、

其中，磷酸胞苷膽堿酰轉(zhuǎn)移酶突變體M1的氨基酸序列與NCBI序列號NP_011718.1的磷酸胞苷膽堿酰轉(zhuǎn)移酶的序列相比，將第14位賴氨酸突變?yōu)楣劝彼帷⒌?5位賴氨酸突變?yōu)楣劝彼帷⒌?8位賴氨酸突變?yōu)樘於彼帷⒌?71位的亮氨酸突變?yōu)樘於彼帷⒌?09位的精氨酸突變?yōu)樘於彼幔隽姿岚漳憠A酰轉(zhuǎn)移酶突變體M1的氨基酸序列如SEQID NO:1所示。

磷酸膽堿胞苷酰轉(zhuǎn)移酶突變體M2的氨基酸與磷酸膽堿胞苷酰轉(zhuǎn)移酶突變體M1相比，將第28位的賴氨酸突變?yōu)楣劝彼帷⒌?4位的氨基酸賴氨酸突變?yōu)樘於彼幔瑢⒌?2位的賴氨酸突變?yōu)樘於彼幔瑢⒌?2位的脯氨酸突變?yōu)樘於彼幔瑢⒌?15位的亮氨酸突變?yōu)樘於彼幔隽姿崮憠A胞苷酰轉(zhuǎn)移酶突變體M2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

磷酸膽堿胞苷酰轉(zhuǎn)移酶突變體M3的氨基酸與磷酸膽堿胞苷酰轉(zhuǎn)移酶突變體M2相比，將第9位的絲氨酸突變?yōu)楣劝彼幔瑢⒌?6位的蘇氨酸突變?yōu)楣劝彼幔瑢⒌?04位的賴氨酸突變?yōu)樘於彼幔瑢⒌?16位的異亮氨酸突變?yōu)樘於彼幔瑢⒌?20位的亮氨酸突變?yōu)樘於彼幔瑢⒌?29位的天冬酰胺突變?yōu)楣劝彼幔瑢⒌?48位的丙氨酸突變?yōu)樘於彼幔瑢⒌?65位的脯氨酸突變?yōu)樘於彼幔瑢⒌?10位的亮氨酸突變?yōu)樘於彼幔隽姿崮憠A胞苷酰轉(zhuǎn)移酶突變體M3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

編碼上述磷酸膽堿胞苷酰轉(zhuǎn)移酶突變體的核苷酸序列也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

具體地，SEQ ID NO:1對應(yīng)的堿基序列如SEQ ID NO:4所示；SEQ NO.2對應(yīng)的堿基序列如SEQ ID NO:5所示：SEQ ID NO:3對應(yīng)的堿基序列如SEQ ID NO:6所示。

進(jìn)一步地，本發(fā)明提出了包含上述編碼磷酸膽堿胞苷酰轉(zhuǎn)移酶突變體的核苷酸序列的表達(dá)載體，優(yōu)選地，所述表達(dá)載體為pET-28a。

更進(jìn)一步地，本發(fā)明提出了一種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含上述表達(dá)載體。優(yōu)選地，所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌BL21(DE3)。

本發(fā)明進(jìn)一步提出了上述磷酸膽堿胞苷酰轉(zhuǎn)移酶突變體M1-M3在制備胞苷二磷酸膽堿上的應(yīng)用。

有益效果：本發(fā)明通過對野生型的磷酸膽堿胞苷酰轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行理性設(shè)計(jì)，意外的篩選得到3種高耐鹽性的磷酸膽堿胞苷酰轉(zhuǎn)移酶突變體，發(fā)酵過程中能提高CDP-膽堿的產(chǎn)量，滿足工業(yè)生產(chǎn)需求。

具體實(shí)施方式