[發明專利]基于丁基羅丹明B熒光猝滅法測定血清過氧化氫酶活度的方法

在審

• 申請號: 202210065184.4
• 申請日: 2022-01-20
• 公開（公告）號: CN114397284A
• 公開（公告）日: 2022-04-26
• 發明（設計）人: 董娜;張愛菊;白瑩;張小林
• 申請（專利權）人: 甘肅醫學院
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 西安合創非凡知識產權代理事務所(普通合伙) 61248
• 代理人: 支思迪

本發明涉及CAT活度測定領域，具體涉及一種基于丁基羅丹明B熒光猝滅法測定血清過氧化氫酶活度的方法，其基于Fenton試劑(H₂O₂/Fe²⁺)作用下的丁基羅丹明B(b?RhB)熒光猝滅體系完成過氧化氫酶(CAT)活度測定，在Fe²⁺的作用下，b?RhB遇H₂O₂出現熒光猝滅，基于加酶前后的熒光變化值確定CAT活度。熒光變化△F與CAT活度E(U/mL)在0.0005～0.05 U/mL活度范圍內有良好的線性關系：△F=?1.476+1205E，r=0.9974，檢測限最低為2.49×10^?5 U/mL。本發明操作簡便、成本低、條件易控、結果準確，可直接用于人體血清CAT活度分析。

技術領域

本發明涉及CAT活度測定領域，具體涉及一種基于丁基羅丹明B熒光猝滅法測定血清過氧化氫酶活度的方法。

背景技術

過氧化氫酶(catalase，CAT)是分解H₂O₂的專一酶，大量存在于人體組織、細胞中，具有重要的防御功能，與人體健康密切相關，測定血清CAT活度廣受臨床經驗工作者重視。以CAT活度測定為題發表的文章不計其數，目前主要集中于滴定法和可見分光光度法等領域。熒光法具有高選擇、低檢出等優異特性，羅丹明類染料作為熒光探針試劑現多用于生物化學和藥物分析，丁基羅丹明B結構中含有C=N基團，在釋放熒光的同時，更容易被H₂O₂氧化，出現瞬間熒光猝滅現象。基于此，本發明提出了一種基于Fenton試劑（H₂O₂/Fe²⁺)作用下的熒光猝滅測定CAT活度的新方法。

發明內容

本發明提供的一種基于丁基羅丹明B熒光猝滅法測定血清過氧化氫酶活度的方法，其基于Fenton試劑作用下的丁基羅丹明B熒光猝滅體系完成過氧化氫酶活度測定，優于羅丹明B熒光靜態猝滅法，過程得以簡化，穩定性更高，可直接用于人體血清CAT活度分析，無需繁雜的樣品加工處理，有效克服血清自身濁度、色度及共存物質的干擾，臨床應用前景廣闊。

為實現上述目的，本發明采取的技術方案為：

基于Fenton試劑作用下的熒光猝滅測定CAT活度的方法，在Fe²⁺的作用下，b-RhB遇H₂O₂出現熒光猝滅，基于加酶前后的熒光變化值確定CAT活度。測定時，取人體血清50 μL置于50 mL容量瓶中，加2.50 mL 濃度為1 U/mL 的H₂O₂底液，30 ℃恒溫反應16 min，再依次加入3.50 mL b-RhB、2.50 mL HAc-NaAc緩沖液、0.40 mL Fe²⁺溶液，室溫反應20 min后定容，靜置1 min，在1 cm吸收池中測定590 nm發射波長處熒光強度F，同步測定酶空白體系F₀，CAT活度E (1 mL CAT溶液所消耗H₂O₂物質的量(μmol))由△F確定，其中，△F = F -F₀。

進一步地，酶空白體系F₀通過以下步驟測定：