[發明專利]一種巴氏生孢八疊球菌的培養方法

在審

• 申請號: 202210060736.2
• 申請日: 2022-01-19
• 公開（公告）號: CN114231468A
• 公開（公告）日: 2022-03-25
• 發明（設計）人: 徐晶;王先志;姚武
• 申請（專利權）人: 同濟大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12R1/01
• 代理公司: 上海科盛知識產權代理有限公司 31225
• 代理人: 褚明偉

本發明涉及微生物發酵工程技術領域，尤其是涉及一種巴氏生孢八疊球菌的培養方法。本發明首先將巴氏生孢八疊球菌在固體活化培養基中進行活化，得到活化菌種；然后將活化菌種接種至液體種子培養基中進行培養，從中選取單位脲酶活性高于5.0U/ml/OD₆₀₀的菌液作為種子液；最后將種子液接種至液體芽孢培養基中發酵培養，得到具有高單位脲酶活性及高形孢密度的巴氏生孢八疊球菌。本發明通過連續三個階段的培養，在獲得高單位脲酶活性巴氏生孢八疊球菌的同時獲得高形孢密度的巴氏生孢八疊球菌，并大幅縮短培養周期，降低生產成本，且本發明操作簡便，具有很強的實用性。

技術領域

本發明涉及微生物發酵工程技術領域，尤其是涉及一種巴氏生孢八疊球菌的培養方法。

背景技術

作為一種脆性材料，混凝土在外界環境因素作用下容易發生開裂形成微裂縫。盡管微裂縫對混凝土力學性能造成的負面影響可忽略不計，但這些微裂縫為外界二氧化碳、硫酸根、氯離子等侵蝕性物質進入混凝土內部提供通道，從而引起混凝土結構的劣化及內部鋼筋的銹蝕，嚴重影響混凝土耐久性，并進一步造成力學性能損失。傳統修復裂縫的方式是人工定期檢修和維護，但費工費力，且某些特殊部位的裂縫修復難以施工。目前，通過預埋微生物礦化組分已能夠實現混凝土微裂縫的主動愈合。其中常用的微生物制劑主要為巴氏生孢八疊球菌，該類菌種能大量分泌脲酶，可發揮催化作用快速分解尿素，從而誘導生成碳酸鈣礦物并實現微裂縫的愈合，避免外界侵蝕性物質的進入混凝土內部。

然而預埋微生物礦化組分是在混凝土拌合階段，由于混凝土攪拌的高剪切應力、水泥水化熱以及水化產生的高堿性環境將對微生物造成損傷，而混凝土后期硬化的孔徑減小以及內部的持續干燥也對微生物的存活造成很大壓力。

在營養物質耗盡等不利條件下，巴氏生孢八疊球菌會逐漸形成休眠的芽孢體，具有很強的抗逆性，能夠抵抗高堿性、高溫、干旱等惡劣環境。將微生物直接以休眠態的方式引入到混凝土內部，可避免上述過程對微生物造成的負面影響。當混凝土發生開裂時，外部氧氣和水分的進入，將激活預埋芽孢并進行萌發和生長，進而誘導礦化沉積，以實現混凝土微裂縫的主動愈合。然而在培養微生物過程中，采用市面常見的培養手段所培養的微生物不僅脲酶活性較低，其芽孢的生成密度亦偏少，阻礙了其在混凝土裂縫自修復中的應用。

李萌等以ATCC11859的巴氏芽孢八疊球菌為出發菌株，采用亞硝基胍誘變以提高菌株產脲酶的能力，其所獲得的單位脲酶活性最高為1U/ml/OD₆₀₀。然而誘變方法操作復雜，隨機性高；亞硝基胍在堿性條件下會形成重氮甲烷，其受到撞擊后會導致爆炸，操作過程極度危險；亞硝基胍也是一種強烈的致癌物質，對操作人員極易造成傷害。另外，該方法未涉及菌株高形孢密度的培養。

CN107723259A公開了一種培養具有高脲酶活性的巴氏生孢八疊球菌的方法，包括采用A和B順序的雙培養基培養巴氏生孢八疊球菌，在單菌落培養和菌種復活階段采用A培養基，在菌種擴大培養階段采用B培養基，該技術方案無法形成高形孢密度的菌株。

CN112553121A公開了一種耐高溫芽孢桿菌超高密度固體發酵方法，包括首先在LB固體培養基中活化，再轉接至LB液體培養基中培養，最后固體發酵，該技術方案無法形成高的芽孢密度，且無法同時產生高單位脲酶活性。

因此，提出了一種針對巴氏生孢八疊球菌的高單位脲酶活性及高形孢密度培養方法是非常重要的。

發明內容

為了解決上述問題，本發明的目的是提供一種巴氏生孢八疊球菌的培養方法，本發明首先將巴氏生孢八疊球菌在固體活化培養基中進行活化，得到活化菌種；然后將活化菌種接種至液體種子培養基中進行培養，從中選取單位脲酶活性高于5.0 U/ml/OD₆₀₀的菌液作為種子液；最后將種子液接種至液體芽孢培養基中發酵培養，得到具有高單位脲酶活性及高形孢密度的巴氏生孢八疊球菌。本發明通過連續三個階段的培養，在獲得高單位脲酶活性巴氏生孢八疊球菌的同時獲得高形孢密度的巴氏生孢八疊球菌，并大幅縮短培養周期，降低生產成本，且本發明操作簡便，具有很強的實用性。