[發明專利]一種降低或消除重組蛋白CEX酸性峰的方法

有效

• 申請號: 202210057229.3
• 申請日: 2022-01-19
• 公開（公告）號: CN114085291B
• 公開（公告）日: 2022-04-12
• 發明（設計）人: 湯玉環;董無善;歐陽子均;李綱
• 申請（專利權）人: 邁威（上海）生物科技股份有限公司
• 主分類號: C07K16/46
• 分類號: C07K16/46;C07K1/18
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明針對含有GS類連接子的重組蛋白純化后存在影響生物活性酸性峰的技術問題，根據酸性峰的產生受GS類連接子中絲氨酸殘基上以木糖為核心的O?糖基化修飾影響的機理，提供了一種除去重組蛋白酸性峰的方法，采用多模式陰離子交換層析，除去O?木糖修飾酸性變異體，通過陽離子交換色譜鑒定重組蛋白酸性峰降低至30%以下。本發明所述方法尤其適用于重組雙特異性抗體（例如抗NKG2A/PD?L1雙特異性抗體）親和層析后的進一步純化。

技術領域

本發明涉及藥物純化工藝研究領域，特別是涉及一種降低或消除重組蛋白陽離子交換色譜（CEX）酸性峰的方法。具體而言，本發明涉及一種降低或消除重組人源化抗NKG2A和PD-L1雙特異性抗體（6MW3411雙抗）中含O-木糖修飾的酸性變異體的純化方法。

背景技術

近幾年來，腫瘤免疫治療取得了前所未有的成功，仍只有少數患者表現出持久的療效。改善臨床響應以及克服耐藥機制是腫瘤免疫治療領域正面臨的挑戰，而阻斷其它抑制性免疫受體可能是一種可行的策略。

NKG2A（killer cell lectin like receptor C1）又名KLRC1或CD159A，是一類II型跨膜蛋白，屬于NKG2/CD94自然殺傷細胞凝集素受體家族。NKG2A在胞外具有識別碳水化合物的結構域CRD(Carbohydrate-recognitiondomain，通常由115-130個氨基酸組成，含2-3個二硫鍵，有2-3個N連接的糖基化位點，其配體識別的過程往往是Ca2+依賴性的)。NKG2A主要在NK細胞、NKT細胞以及T細胞中表達；相對分子質量為43000，由233個氨基酸組成，其胞外區有135個氨基酸。NKG2A通過與其配體HLA-E的相互作用來抑制免疫細胞的激活。HLA-E廣泛表達于頭頸癌、肺癌、前列腺癌以及結直腸癌等多種腫瘤細胞表面，而免疫細胞釋放的IFN-γ會進一步上調HLA-E的表達 （J Clin Invest. 2019; 129(5): 2094-2106）。與其它受體-配體（如PD-1/PD-L1）類似，NKG2A/HLA-E這對免疫檢查點也是腫瘤免疫逃逸的重要信號通路，阻斷NKG2A/HLA-E之間的相互作用成為了腫瘤免疫治療領域一個非常有潛力的靶點。目前有多家公司（如Innate Pharma/Novo Nordisk/AstraZeneca 和 ChemPartner）開發了針對NKG2A的單克隆抗體，通過阻斷NKG2A/HLA-E的相互作用來提高NK細胞以及T細胞的免疫活性來殺傷腫瘤細胞。

最新的研究發現，NKG2A與PD-1在頭頸癌及黑色素瘤浸潤性的CD8+ T細胞上共表達，同時阻斷NKG2A/HLA-E及PD-1/PD-L1兩條信號通路有很強的協同抗腫瘤作用（Cell.2018; 175: 1-13, Cell. 2018; 175: 1744-1755）。同時針對多種靶點進行治療對提高腫瘤免疫治療的響應率及降低免疫耐受有積極的作用。目前針對NKG2A的治療性抗體對抗原的親和力不足、結合NKG2A單靶點對腫瘤的治療效果不佳，全球范圍內尚沒有針對NKG2A的上市藥物。法國Paoli-Calmettes研究院正在推進一項人源化抗NKG2A單抗IPH2201與同種異體干細胞移植聯用治療血液惡性腫瘤的I期臨床安全性實驗（NCT02921685）。申請人已經通過構建輕重鏈突變抗體庫進行親和力提高和/或解離常數改善的突變抗體，將突變抗體的CDRs區構建人Fab重鏈基因表達載體和含人κ亞類輕鏈恒定區基因的哺乳動物細胞表達載體中，將親和力成熟抗體的重鏈載體和輕鏈載體交叉配對，篩選獲得抗NKG2A的突變Fab抗體，連接人抗體Fc段。將抗PD-L1納米抗體通過linker連接到Fc段的C端，獲得對NKG2A和PD-L1具有雙特異性的抗體。