[發明專利]LAMP檢測OXA48家族基因的引物組合物、試劑盒及檢測方法

在審

• 申請號: 202210055981.4
• 申請日: 2022-01-18
• 公開（公告）號: CN114350761A
• 公開（公告）日: 2022-04-15
• 發明（設計）人: 劉金霞;楊思煕;任立群;李冉;王麗娜
• 申請（專利權）人: 承德醫學院
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12Q1/689;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 鄭州慧廣知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 41160
• 代理人: 朱廣存

本發明涉及一種LAMP檢測耐碳青霉烯酶陰溝腸桿菌OXA48家族基因的引物組合物、相應的試劑盒及檢測方法，選擇OXA48家族的共同基因片段，其中包含bla_OXA?48、bla_OXA?181、bla_OXA?232、bla_OXA?204、bla_OXA?162、bla_OXA?244，設計環介導等溫擴增體系中所需引物，對反應體系、反應條件以及染色劑濃度等進行反復優化，建立改良的OXA48家族LAMP檢測的試劑盒。該LAMP檢測試劑盒不僅可以檢測陰溝腸桿菌的OXA48家族基因，還可以推及其他細菌，只要含有該耐藥基因的細菌均可以檢測到。由于LAMP檢測試劑盒操作簡便，操作風險低。

技術領域

本發明屬于分子檢測技術領域，涉及一種引物組合物、試劑盒和檢測方法，具體地說是一種LAMP檢測耐碳青霉烯酶陰溝腸桿菌OXA48家族基因的引物組合物、相應的試劑盒及檢測方法。

背景技術

腸桿菌科細菌是社區和醫院感染中的常見病原菌之一，20世紀80年代以來，碳青霉烯類抗菌藥物一直被認為是對抗產超廣譜β－內酰胺酶(ESBLS)和AmpC酶腸桿菌感染的最有效手段，但近年來臨床上抗菌藥物的過度使用導致耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌(CRE)的產生，并在全球范圍內呈廣泛流行的趨勢。碳青碳青霉烯酶是碳青霉烯水解內酰胺酶，主要包括KPC絲氨酸β-內酰胺酶，NDM、IMP、VIM金屬β-內酰胺酶與OXA48類金屬β-內酰胺酶。這些碳青霉烯類耐藥基因通常存在于質粒，使其能夠在細菌間快速傳播。因此，建立一種快速，特異性強，靈敏度高的診斷方法，對于耐碳青霉烯類細菌的防治具有重要意義。

目前，耐碳青霉烯類細菌的主要診斷方法有改良霍奇實驗(MHT)，Carba NP試驗(CNP)，碳青霉烯類滅活試驗(CIM)，流式細胞術(FC)，基質輔助激光解析電離飛行時間質譜技術(MALDI-TOF-MS)與核酸擴增等方法。改良霍奇實驗所用試劑價格便宜，操作簡便，在2010年美國和臨床實驗室標準化協會(CLSI)推薦其為CRE表型確證實驗，但其耗時長且難以解釋某些結果，不能區分酶類型，2018年已從M100-S28文件中刪除；Carba NP試驗(CNP)快速，準確，但試驗操作繁雜，需特殊試劑，不適合在常規實驗室開展；碳青霉烯滅活試驗(CIM)操作簡單，價格低廉，試劑易獲得，但所需時間較長，不能進行快速檢測；流式細胞術(FC)具有可定量分析、簡便、耗時短等優點，但其所需設備昂貴，未在常規實驗室開展；基質輔助激光解析電離飛行時間質譜技術是一種快速、低成本、高通量的CRE檢測方法，但其只能檢測產酶CRE，且質譜儀價格昂貴，方法尚未標準化；以核酸擴增為基礎的實驗技術，具有快速，靈敏，特異性強的特點，比如PCR、LAMP等。但因PCR技術對操作人員技能有較高要求，需要的熱循環設備價格昂貴而難以推廣，環介導等溫擴增技術克服了上述缺點，具有反應快速，操作簡單的優勢，一臺水浴鍋等恒溫設備即可操作，擴增結果可用肉眼進行判定，對員工簡單培訓即可完成操作，適合在基層醫療機構中應用。但PCR，LAMP等分子生物學檢測法是針對CRE的碳青霉烯酶中的型別進行檢測。如今的LAMP檢測技術已日趨成熟，國內外關于LAMP檢測OXA48家族基因也屢現不鮮，但檢測方式不盡相同。如有學者使用熒光定量PCR儀進行LAMP反應，可以實時記錄曲線，進行定性與半定量檢測，但該儀器昂貴，需要專業人員進行儀器操作；有學者還使用羥基萘酚藍作為LAMP的顯色劑，反應大約1小時左右，但羥基萘酚藍顏色變化不明顯，不同的人肉眼觀測，誤差較大。

發明內容

本發明要解決的技術問題，是要提供一種LAMP檢測耐碳青霉烯酶陰溝腸桿菌OXA48家族基因的引物組合物及相應的試劑盒，該引物組合物的序列設計合理，特異性強，靈敏度高；含有該引物組合物的試劑盒特異性強、靈敏度高，操作方便，可通過肉眼觀察擴增結果；

本發明的另外一個目的，是提供一種LAMP檢測耐碳青霉烯酶陰溝腸桿菌OXA48家族基因的方法，該方法簡單，靈敏度高，檢測過程便捷，擴增時間較短，節省時間，25-30分鐘即可完成擴增，擴增結果通過肉眼進行觀察。