[發明專利]深海鏈霉菌基因工程突變株生產怡萊霉素E的高產培養基及其規?；l酵工藝

在審

• 申請號: 202210055630.3
• 申請日: 2022-01-18
• 公開（公告）號: CN114540446A
• 公開（公告）日: 2022-05-27
• 發明（設計）人: 安法梁;鄭高帆;朱云飛;鞠建華;馬俊英
• 申請（專利權）人: 華東理工大學
• 主分類號: C12P21/04
• 分類號: C12P21/04;C12N1/21;C12N15/76;C12N15/53;C12R1/465
• 代理公司: 上海華工專利事務所(普通合伙) 31104
• 代理人: 繆利明;趙孟琴

本發明公開了一種利用深海鏈霉菌SCSIO ZH16生產怡萊霉素E的高產培養基，包括如下重量份的組分：可溶性淀粉96g?144g、黃豆粉16?24g、玉米漿1.92?2.88g、氯化鈉4.8?7.2g、硝酸鈉7.68?11.52g、硫酸銨5.12?7.68g、磷酸二氫鉀0.192?0.288g、以去離子水溶解，并定容至1000mL，用3M氫氧化鈉溶液調節pH至7.2?7.4后，加入1.53?17.67g碳酸鈣。本發明還公開了利用所述的高產培養基發酵生產怡萊霉素E的規?；l酵工藝。本發明的高產培養基，原料易得，價格低廉，有利于推廣應用。且可以提高怡萊霉素E的產量。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體地說，是關于一種深海鏈霉菌基因工程突變株生產怡萊霉素E的高產培養基及其規?；l酵工藝。

背景技術

深海具有復雜而獨特的環境，與淺海相比，在光照，氧氣濃度，壓力，可用養分，鹽度和溫度方面變化極大，是挖掘海洋稀有放線菌資源和結構復雜多樣的次生代謝產物的重要源泉。深海獨特的環境促使深海生物形成了獨特的生理代謝能力，這不僅保證了它們的生存，而且為其產生新穎的代謝產物提供了潛力。如今，基于其強效的抗菌、抗腫瘤、抗氧化等特性，海洋生物活性化合物在功能性食品和藥物的開發中發揮著越來越重要的作用。

深海鏈霉菌S.atratus SCSIO ZH16(GenBank登錄號為KT9708)可以生產一類含有三種非蛋白質氨基酸(N-取代色氨酸、2-氨基-4-己烯酸、和3-硝基酪氨酸)分環七肽家族化合物--怡萊霉素。該菌株能夠主要生產一種具有強效抗結核桿菌活性及抗三陰性乳腺癌活性的天然產物怡萊霉素E，具有廣泛的開發應用前景。然而，怡萊霉素E在初始發酵工藝下的得率很低，嚴重制約怡萊霉素E的系統生物活性研究，成為臨床前研究瓶頸。因此，通過基因編輯手段獲得怡萊霉素E高產基因工程突變株，開發高產培養基，提高怡萊霉素E滴度，優化規?；l酵工藝和過程參數，實現規模化發酵勢在必行。

培養基是微生物生存的物質基礎，營養成分合適的培養基對于微生物生長及代謝至關重要。不同微生物的生長及代謝對營養物質的要求均不同，同一微生物在菌體生長和次級代謝產物生產的過程中對營養物質的需求也不同。

發明內容

本發明針對以上瓶頸問題，首先，對發酵生產怡萊霉素E的培養基進行優化研究，以獲得高產培養基配方。實驗首先對于碳、氮源種類進行優化，后續通過Plaekett-Burman實驗設計，篩選出培養基組成中對怡萊霉素E滴度有顯著性影響的組分(顯著影響因子)，進而通過響應面優化方法對顯著影響因子的添加濃度進行優化，最終得到適合怡萊霉素E的高產培養基配方。因此，本發明的第一個目的是提供一種適合深海鏈霉菌生產怡萊霉素E的高產培養基。

其次，本發明在文獻報道的怡萊霉素生物合成途徑的基礎上，運用CRISPR-Cas9基因編輯技術敲除了怡萊霉素生物合成基因簇中編碼細胞色素P450單加氧酶的ilaR后，阻斷生物合成途徑，提升怡萊霉素E的滴度，獲得基因工程菌株深海鏈霉菌SCSIO ZH16ΔilaR。然后，采用高產培養基進行發酵生產可以顯著提升怡萊霉素E滴度，并降低怡萊霉素結構種類，利于后續分離純化。因此，本發明的第二個目的是提供一株能高效生產怡萊霉素E的基因工程菌株SCSIO ZH16ΔilaR。

再次，本發明通過噬菌體(如ΦC31，ΦBT1和TG1)附著/整合(Att/Int)系統，選用ΦC31位點特異性整合，過表達怡萊霉素生物合成基因簇簇內正調控因子ilaB。成功構建深海鏈霉菌SCSIO ZH16ΔilaR ilaB::ermE*菌株，采用高產培養基進行發酵，進一步提高怡萊霉素E發酵滴度。因此，本發明的第三個目的是提供一株能高效生產怡萊霉素E的基因工程菌株SCSIO ZH16ΔilaR ilaB::ermE*。