[發明專利]深海鏈霉菌基因工程突變株生產怡萊霉素E的高產培養基及其規?；l酵工藝

在審

• 申請號: 202210055630.3
• 申請日: 2022-01-18
• 公開（公告）號: CN114540446A
• 公開（公告）日: 2022-05-27
• 發明（設計）人: 安法梁;鄭高帆;朱云飛;鞠建華;馬俊英
• 申請（專利權）人: 華東理工大學
• 主分類號: C12P21/04
• 分類號: C12P21/04;C12N1/21;C12N15/76;C12N15/53;C12R1/465
• 代理公司: 上海華工專利事務所(普通合伙) 31104
• 代理人: 繆利明;趙孟琴

1.一種利用深海鏈霉菌SCSIO ZH16生產怡萊霉素E的高產培養基，其特征在于，包括如下重量份的組分：

可溶性淀粉96g-144g、黃豆粉16-24g、玉米漿1.92-2.88g、氯化鈉4.8-7.2g、硝酸鈉7.68-11.52g、硫酸銨5.12-7.68g、磷酸二氫鉀0.192-0.288g、以去離子水溶解，并定容至1000mL，用3M氫氧化鈉溶液調節pH至7.2-7.4后，加入1.53-17.67g碳酸鈣。

2.如權利要求1所述的高產培養基，其特征在于，包括如下重量份的組分：

可溶性淀粉120g、黃豆粉23.488g、玉米漿2.4g、氯化鈉6g、硝酸鈉9.6g、硫酸銨4.677g、磷酸二氫鉀0.24g、以去離子水溶解，并定容至1000mL，用3M氫氧化鈉溶液調節pH至7.2-7.4后，加入17.670g碳酸鈣。

3.一種高效生產怡萊霉素E的基因工程菌株S.atratus SCSIO ZH16ΔilaR，其特征在于，其是基于CRISPR-Cas9基因編輯技術，運用基因敲除質粒敲除S.atratus SCSIO ZH16中ilaR基因后獲得。

4.如權利要求3所述的基因工程菌株S.atratus SCSIO ZH16ΔilaR，其特征在于，所述敲除質粒為PKCCas9dilaR，其是通過酶切連接的方法，將用限制性內切酶SpeI及HindIII切割后的PKCCas9dO質粒和ilaR基因第190位堿基區域組裝有向導RNA的上游片段及下游片段連接，然后轉化至E.coil DH5α中獲得，其中，裝有向導RNA的上游片段是以鏈霉菌S.atratus SCSIO ZH16基因組DNA為模板通過如SEQ ID NO.2所示的引物UR-F和如SEQ IDNO.3所示的引物UR-R進行PCR擴增獲得長度為1114bp的片段1后，再以片段1為模板通過如SEQ ID NO.4所示的引物SGR和如SEQ ID NO.3所示的引物UR-R進行PCR擴增后獲得的；下游片段是以鏈霉菌S.atratus SCSIO ZH16基因組DNA為模板通過如SEQ ID NO.5所示的引物DR-F與如SEQ ID NO.6所示的引物DR-R進行PCR擴增后獲得的。

5.一種高效生產怡萊霉素E的基因工程菌株SCSIO ZH16ΔilaR ilaB::ermE*，其特征在于，其是在S.atratus SCSIO ZH16ΔilaR基礎上通過噬菌體ΦC31位點整合系統過表達ilaB基因獲得。

6.一種如權利要求5所述的高效生產怡萊霉素E的基因工程菌株SCSIO ZH16ΔilaRilaB::ermE*的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟一、通過酶切連接的方法，將用限制性內切酶NdeI及EcoRI切割后的pIB139質粒和外源ilaB基因連接轉化至E.coil DH5α中獲得pIB139-ilaB重組質粒；

步驟二、通過接合轉移的方法，將pIB139-ilaB重組質粒導入E.coil S17-1感受態細胞中構建獲得含有pIB139-ilaB重組質粒的E.coil S17-1；

步驟三、將含有pIB139-ilaB重組質粒的E.coil S17-1與S.atratus SCSIO ZH16ΔilaR菌株接合而成。

7.一種如權利要求5所述的高效生產怡萊霉素E的基因工程菌株SCSIO ZH16ΔilaRilaB::ermE*在反應器水平上規?；l酵生產怡萊霉素E中的應用。

8.一種使用如權利要求1或2所述的高產培養基發酵生產怡萊霉素E的發酵方法，其特征在于，其是將深海鏈霉菌種子液接種于如權利要求1或2所述的高產培養基中進行發酵，獲得怡萊霉素E。