[發明專利]肝樣細胞和人工肝組織的制備方法以及應用

在審

• 申請號: 202210049108.4
• 申請日: 2022-01-17
• 公開（公告）號: CN116478904A
• 公開（公告）日: 2023-07-25
• 發明（設計）人: 陳漢輝;鄧帥
• 申請（專利權）人: 香港中文大學
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N5/0735;C12Q1/02;A61L27/38;A61K35/407;A61P1/16
• 代理公司: 北京英賽嘉華知識產權代理有限責任公司 11204
• 代理人: 王達佐;洪欣

本申請提供了將多能干細胞誘導為肝樣細胞團的方法，其包括將多能干細胞封裝在第一微凝膠中進行分化培養，得到所述肝樣細胞團。本申請還提供了人工肝組織的制備方法，其包括將通過上述方法制備的肝樣細胞團與其它功能細胞封裝在第二水凝膠中進行培養，得到所述人工肝組織。本申請還提供了通過上述方法制備的肝樣細胞團和人工肝組織及其用途。

發明領域

本申請屬于生物與新醫藥技術領域，具體地，涉及誘導多能干細胞分化為肝樣細胞團的方法以及通過肝樣細胞團制備人工肝組織的方法。

發明背景

肝臟是人體最重要的器官之一并承擔著許多重要功能，而肝臟中的肝功能主要是由肝細胞所提供。在大多數肝病中，肝細胞逐漸減少并進一步導致肝衰竭，而肝移植是目前唯一有效的肝衰竭的治療方式。然而由于肝臟供體數量有限，中國香港特別行政區每年約有40％的人在等待肝移植的過程中死亡。因此，嘗試肝細胞移植療法或構建人工肝組織作為肝移植的替代療法具有重要的臨床意義。除了臨床需求，肝細胞也可用于體外藥物代謝研究和藥物毒理評價。藥物性肝損傷是到達臨床試驗的許多藥物的主要障礙，許多創新藥因毒性問題而下架。這其中部分是由于用于評估藥物肝損傷的體外細胞模型和小鼠毒性模型的限制。然而由于新鮮肝組織中分離的肝細胞數量有限，同時肝細胞在體外具有不可增殖的特點，因此目前工業上和臨床上對于優質來源的肝細胞仍然有著迫切需求。

目前已經有研究表明多能干細胞可以用于肝方向的分化，然而大部分多能干細胞產生的肝樣細胞僅僅表達胎兒肝細胞標志物同時缺乏主要的藥物代謝酶細胞色素P450(CYP)活性。因此，迄今為止還沒有人工分化的肝樣細胞進入臨床實驗。因此，促進多能干細胞分化的不成熟的胎兒肝樣細胞進一步分化為具有成體肝細胞特性的肝樣細胞具有重要的臨床意義。

肝細胞移植療法的另一個挑戰是植入的肝細胞在肝臟中難以留存，而利用成熟的肝樣細胞構建人工肝組織從而幫助肝細胞在肝臟中定植是一種可能的解決辦法。在傳統的構建人工肝組織的方法中(如將干細胞接種到水凝膠或聚合物支架中)，由于缺乏血管，營養交換會受到限制，因此構建的人工肝組織的大小具有局限性。雖然3D打印技術可以用于構建血管化的組織，但對用于打印的“生物墨水”(生物材料和細胞的混合物)有著極高要求，這限制了3D打印在構建可植入人體的組織中的應用。使用脫細胞支架也可以構建血管化的人工肝組織，但將細胞注入支架的過程繁瑣，并且難以精確控制細胞的接種位置，因此難以建立功能性的血管網絡。

鑒于可用于臨床的成熟的肝樣細胞和人工肝組織的缺乏，開發出新的能夠產生大量成熟可用的肝樣細胞的方法以及構建人工肝組織的方法對于肝臟臨床醫學和再生醫學的研究有著重要的意義。

發明概述

第一方面，本申請提供了將多能干細胞誘導為肝樣細胞團的方法，其包括將多能干細胞封裝在第一微凝膠中進行分化培養，產生具有成熟肝功能的肝樣細胞團。

在第一方面的一些實施方案中，所述多能干細胞為胚胎干細胞或誘導性多能干細胞。

在第一方面的一些實施方案中，所述第一微凝膠包含膠原蛋白。

在第一方面的一些實施方案中，所述第一微凝膠的大小為80-120μm。

在第一方面的一些實施方案中，所述第一微凝膠包含10-20個所述多能干細胞。

在第一方面的一些實施方案中，所述培養的時間為至少17天。

在第一方面的一些實施方案中，所述培養包括以下階段：分化為定形內胚層的階段；分化為肝母細胞團的階段；以及肝母細胞團進一步分化和成熟的階段。

第二方面，本申請提供了肝樣細胞團，其通過第一方面所述的方法制備。

第三方面，本申請提供了人工肝組織的制備方法，其包括將通過第一方面所述的方法制備的肝樣細胞團或第二方面所述的肝樣細胞團與其它功能細胞封裝在第二水凝膠中進行培養，得到所述人工肝組織。