[發明專利]用于耐藥基因檢測的藍藻環境樣品胞內外DNA分離提取方法

在審

• 申請號: 202210048545.4
• 申請日: 2022-01-17
• 公開（公告）號: CN114540462A
• 公開（公告）日: 2022-05-27
• 發明（設計）人: 陳求穩;王智源;張建云;黃玉;丁玨;嚴晗璐;林育青;陳誠;劉東升;閆丹丹;隗嵐琳
• 申請（專利權）人: 水利部交通運輸部國家能源局南京水利科學研究院
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12Q1/04;C12Q1/686;G01N21/64
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 劉紅陽

本發明公開了用于耐藥基因檢測的藍藻環境樣品胞內外DNA分離提取方法，包括將待測藍藻環境樣品濃縮和清洗，然后確認藻液中雜菌對溶菌酶具有敏感性；藻液中加入溶菌酶溶液去除其中的雜菌，然后去除剩余溶菌酶溶液，得到預處理后的藻液；預處理后藻液轉代培養，檢測轉代培養后的藻液中是否仍存在雜菌；若是，則重復去除雜菌的步驟，直至轉代培養后的藻液中無雜菌；若否，則分離提取預處理后藻液的胞外和胞內DNA。本發明操作簡單、節省時間，提取的藍藻環境樣品DNA純度高、完整性好，避免了傳統抗生素滅除雜菌方法對藍藻樣品中待測抗生素耐藥基因表達水平的干擾，有效提升了后續藍藻環境樣品抗生素耐藥基因分子生物學檢測的準確性，具有廣泛的應用前景。

技術領域

本發明涉及一種DNA分離提取方法，尤其涉及一種用于耐藥基因檢測的藍藻環境樣品胞外和胞內DNA分離提取方法。

背景技術

隨著醫療和養殖業中抗生素的長期濫用，大量未被生物體充分吸收和代謝的抗生素隨城市尾水、養殖廢水等途徑直接或間接進入河湖水生態系統。抗生素的持續環境殘留對環境微生物群落施加進化選擇壓力，催生了具有多重耐藥基因的抗性細菌。河湖水環境已成為抗生素耐藥基因(ARGs)及其分子傳播元件的重要基因庫，并促進了ARGs的傳播擴散。全球每年約70萬人死于耐藥性病原菌感染，抗生素耐藥性已成為全球性的環境健康熱點問題。

藍藻是水生食物鏈的主要初級生產者，是河湖水生態系統物質循環和能量流通的基礎，其群落結構分布和初級生產量直接影響水生態系統的結構穩定性和功能完整性，是水生態系統平衡和水環境演變的重要指示物種。藍藻又名藍細菌，其細胞結構特點和遺傳學特性與革蘭氏陰性細菌相似，具有自然轉化和有效重組系統，是水生態系統中抗生素耐藥基因的重要載體，其抗生素耐藥性通常可作為評價河湖水體抗生素及耐藥基因污染水平的重要依據。藍藻細胞內ARGs的含量是細胞外相應ARGs含量的2～3倍，但是胞外ARGs在環境中存在時間更長，對ARGs的傳播擴散起到更顯著的促進作用。

國內外已有相關研究大多采用實驗室培養條件下獲取的未被污染的純化藍藻單一菌種樣品進行DNA提取和抗生素耐藥基因檢測，或從環境樣品中分離藍藻單一菌種后進行純化和轉代培養再進行DNA提取和抗生素耐藥基因檢測，通常存在分離轉代過程中耐藥基因表達量發生變化導致檢測結果誤差過高、無法真實反映目標水環境抗生素耐藥性的問題。因此，為了更準確地測定藍藻耐藥性水平，最好的方法是采用從水環境中采集的藍藻樣品直接進行胞外和胞內DNA提取和耐藥基因檢測。但是，該方法存在藍藻細胞不易分離純化、雜菌DNA干擾提取效果導致耐藥基因表達量被高估的技術瓶頸，而按照傳統方法采用抗生素進行樣品雜菌去除會誘導藍藻樣品的耐藥性發生響應變化，進一步影響胞外和胞內DNA提取和耐藥基因檢測的準確性。

在全球氣候變暖的背景下，湖泊富營養化程度日益加劇導致全球范圍內藍藻水華暴發的頻次、規模和范圍逐步增加，而抗生素的廣泛使用促進了抗生素耐藥基因在河湖水環境介質尤其是在藍藻中的增殖擴散。目前可用于直接檢測藍藻環境樣品抗生素耐藥基因表達量的胞外和胞內DNA提取方法缺失，影響了藍藻耐藥性水平監測結果的準確性，現有技術對管理部門開展河湖水體抗生素耐藥性評價的指導作用有限。因此，建立藍藻環境樣品抗生素耐藥基因的胞外和胞內DNA精準提取方法，將有助于掌握藍藻宿主中抗生素耐藥基因的歸趨特征、產生過程和傳播機制，為全面準確評價河湖水生態系統抗生素耐藥性提供技術支持，對于深化抗生素耐藥基因水環境行為機理與生態風險控制對策研究具有重要的科學價值。

發明內容

發明目的：本發明旨在提供一種提取的DNA純度高、完整性好的用于抗生素耐藥基因檢測的藍藻環境樣品中胞外和胞內DNA分離提取方法。

技術方案：本發明用于耐藥基因檢測的藍藻環境樣品中胞外和胞內DNA分離提取方法，包括以下步驟：

(1)待測藍藻環境樣品濃縮和清洗，得到藻液；

(2)確認藻液中雜菌對溶菌酶具有敏感性；