[發(fā)明專利]用于耐藥基因檢測的藍(lán)藻環(huán)境樣品胞內(nèi)外DNA分離提取方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202210048545.4
• 申請日: 2022-01-17
• 公開（公告）號: CN114540462A
• 公開（公告）日: 2022-05-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳求穩(wěn);王智源;張建云;黃玉;丁玨;嚴(yán)晗璐;林育青;陳誠;劉東升;閆丹丹;隗嵐琳
• 申請（專利權(quán)）人: 水利部交通運(yùn)輸部國家能源局南京水利科學(xué)研究院
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12Q1/04;C12Q1/686;G01N21/64
• 代理公司: 南京蘇高專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 32204
• 代理人: 劉紅陽

1.一種用于耐藥基因檢測的藍(lán)藻環(huán)境樣品胞內(nèi)外DNA分離提取方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)待測藍(lán)藻環(huán)境樣品濃縮和清洗，得到藻液；

(2)確認(rèn)藻液中雜菌對溶菌酶具有敏感性；

(3)藻液中加入溶菌酶溶液去除其中的雜菌，然后去除剩余溶菌酶溶液，得到預(yù)處理后的藻液；

(4)預(yù)處理后藻液轉(zhuǎn)代培養(yǎng)，檢測轉(zhuǎn)代培養(yǎng)后的藻液中是否仍存在雜菌；若是，則重復(fù)步驟(3)，直至轉(zhuǎn)代培養(yǎng)后的藻液中無雜菌；若否，則繼續(xù)下一步；

(5)分離提取預(yù)處理后藻液的胞外和胞內(nèi)DNA。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于耐藥基因檢測的藍(lán)藻環(huán)境樣品胞內(nèi)外DNA分離提取方法，其特征在于，步驟(2)中，雜菌對溶菌酶敏感性的檢測方法為將藻液中的雜菌菌株分離純化后置于LB無菌液態(tài)培養(yǎng)基，抽取菌液均勻涂抹在含無菌溶菌酶的LB平板培養(yǎng)基上，風(fēng)干后形成菌膜，培養(yǎng)至抗菌圈穩(wěn)定清晰，抗菌圈直徑不少于5mm即可確認(rèn)藍(lán)藻環(huán)境樣品中雜菌的溶菌酶敏感性。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于耐藥基因檢測的藍(lán)藻環(huán)境樣品胞內(nèi)外DNA分離提取方法，其特征在于，步驟(3)中，溶菌酶溶液包括0.005％～0.01％的非離子型表面活性劑、0.1M的乙二胺四乙酸、0.3～0.5mg/mL的溶菌酶、0.25％～0.3％的十二烷基硫酸納溶液、50mM的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液和200mM的氯化鈉。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于耐藥基因檢測的藍(lán)藻環(huán)境樣品胞內(nèi)外DNA分離提取方法，其特征在于，步驟(3)中，去除殘余溶菌酶溶液的方法為：藻液離心分離后加入去離子水離心并去除上清液，反復(fù)清洗若干次。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于耐藥基因檢測的藍(lán)藻環(huán)境樣品胞內(nèi)外DNA分離提取方法，其特征在于，步驟(4)中，將預(yù)處理后藻液分別置于BG11、LB、Martins、Martins和Gause 1的無菌液態(tài)培養(yǎng)基和平板培養(yǎng)基中進(jìn)行轉(zhuǎn)代培養(yǎng)若干次。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于耐藥基因檢測的藍(lán)藻環(huán)境樣品胞內(nèi)外DNA分離提取方法，其特征在于，步驟(4)中，雜菌的檢測方法為采用熒光顯微鏡鏡檢法和PCR-DGGE擴(kuò)增檢測法。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用于耐藥基因檢測的藍(lán)藻環(huán)境樣品胞內(nèi)外DNA分離提取方法，其特征在于，熒光顯微鏡鏡檢法包括將DAPI細(xì)胞染料加入藻液中，然后熒光顯微鏡對藻液進(jìn)行鏡檢，鏡檢圖像中未出現(xiàn)綠色或藍(lán)色熒光小型顆粒或斑點(diǎn)，確認(rèn)無殘留雜菌。

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用于耐藥基因檢測的藍(lán)藻環(huán)境樣品胞內(nèi)外DNA分離提取方法，其特征在于，PCR-DGGE擴(kuò)增檢測法包括提取澡液中DNA，選用適合細(xì)菌的V3區(qū)特異性引物，采用16S rDNA-PCR-DGGE法檢測目標(biāo)菌落是否存在。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于耐藥基因檢測的藍(lán)藻環(huán)境樣品胞內(nèi)外DNA分離提取方法，其特征在于，步驟(5)中，分離胞外DNA使用的試劑包括磷酸二氫鈉緩沖液和聚乙烯聚吡咯烷酮。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的用于耐藥基因檢測的藍(lán)藻環(huán)境樣品胞內(nèi)外DNA分離提取方法，其特征在于，利用柱式細(xì)菌總DNA抽提試劑盒提取胞外和胞內(nèi)DNA。