[發明專利]SOD3在調控雙氫青蒿素誘導的脾臟增大及免疫細胞異質性藥物篩選或疫苗評價中的應用

在審

• 申請號: 202210048341.0
• 申請日: 2022-01-17
• 公開（公告）號: CN114480553A
• 公開（公告）日: 2022-05-13
• 發明（設計）人: 陳啟軍;姜寧;張義偉;李其龍;陳冉;馮穎
• 申請（專利權）人: 沈陽農業大學
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02;C12Q1/6869;C12Q1/6883;G01N33/569;G01N15/10;G01N15/14;G01N21/64
• 代理公司: 遼寧沈陽國興知識產權代理有限公司 21100
• 代理人: 姜婷婷

1.SOD3在調控雙氫青蒿素誘導的脾臟增大及免疫細胞異質性藥物篩選或疫苗評價中的應用。

2.根據權利要求1所述的SOD3在調控雙氫青蒿素誘導的脾臟增大及免疫細胞異質性藥物篩選或疫苗評價中的應用，其特征在于所述的雙氫青蒿素在調控脾臟增大及免疫細胞異質性的檢測方法，包括如下步驟：

步驟1，將0.1 g羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）加入到20 mL加熱至100℃的蒸餾水中，在磁力攪拌器中攪拌3-5 h，當溫度恢復至室溫時，加入0.2 g 雙氫青蒿素（DHA），4℃避光連續攪拌10-12h，得到雙氫青蒿素溶液；

步驟2，給小鼠連續灌胃100mg/kg/d雙氫青蒿素溶液26天后，取小鼠脾臟；

步驟3，將小鼠脾臟置于70 μm的細胞篩上，細胞篩下面放置一個50 mL的離心管，用注射器尾部帶棱面研磨，同時加入預冷PBS沖洗，收集細胞懸液于15 mL的離心管中；

步驟4，上述步驟3中的細胞懸液1500 rpm/min離心5 min，吸去上清，留沉淀，用紅細胞裂解液裂解紅細胞，混勻后冰上靜止3 min；

步驟5，上述步驟4中裂解紅細胞后的細胞懸液1500 rpm/min離心5 min，吸去上清，留沉淀，加入預冷5 mL PBS重懸，洗滌3遍，從而制備雙氫青蒿素誘導的免疫細胞亞群懸濁液；

步驟6，使用熒光顯微鏡及血球計數板計算小鼠脾臟免疫細胞數量；

步驟7，使用流式細胞術及單細胞轉錄組測序方法測定雙氫青蒿素誘導的免疫細胞亞群的異質性。

3.根據權利要求2所述的SOD3在調控雙氫青蒿素誘導的脾臟增大及免疫細胞異質性藥物篩選或疫苗評價中的應用，其特征在于所述的小鼠選體重18-20g的健康雌性BALB/c小鼠，所有小鼠均飼養于無特定微生物的小動物房中，保持黑暗12小時和光照12小時。

4.根據權利要求2所述的SOD3在調控雙氫青蒿素誘導的脾臟增大及免疫細胞異質性藥物篩選或疫苗評價中的應用，其特征在于所述的步驟4中，紅細胞裂解液為155 mM NH 4Cl，10 mM KHCO3，0.11 mM EDTA.Na2，pH 7.2。

5.根據權利要求2所述的SOD3在調控雙氫青蒿素誘導的脾臟增大及免疫細胞異質性藥物篩選或疫苗評價中的應用，其特征在于所述的步驟7中，使用流式細胞術測定雙氫青蒿素溶液誘導的免疫細胞亞群的方法，包括下述步驟：

（1）將所獲得的脾臟單細胞懸浮在含有 0.04% BSA 的 PBS 中；

（2）制備不同組合的流式抗體組合，流式抗體組合如下：

第一組抗體，7AAD、抗CD45-pacific blue抗體、抗CD3-PE抗體、抗CD4-APC/Fire?750抗體、抗CD8a -FITC抗體、抗CD19-BV510抗體、抗 CD45R/B220-APC抗體；

第二組抗體，7AAD、抗CD45-pacific blue抗體、抗CD11b-APC抗體、抗 Ly-6G/Ly-6C(Gr-1)-FITC抗體;

（3）將待測樣本分別加入到流式管A和B中，使呈單個細胞懸液狀態，并保證細胞量1×10 6/管-1×10 7/管；所述待測樣本為脾臟；

（4）向步驟（3）處理得到的流式管A中加入本發明所述的試劑組合物中的第一組抗體，向步驟（3）處理得到的流式管B中加入本發明所述的試劑組合物中的第二組抗體，各流式管4度條件下避光孵育30分鐘；

（5）孵育結束后，向步驟（4）每管加入700 μL PBS，混勻，1500 rpm/min離心5 min，洗滌2次，吸去上清，留沉淀；

（6）向步驟（5）去上清后的流式管中，分別加入PBS緩沖液洗滌，離心后去上清，用PBS緩沖液重懸細胞，即得到流式細胞上機樣品。

6.根據權利要求2所述的SOD3在調控雙氫青蒿素誘導的脾臟增大及免疫細胞異質性藥物篩選或疫苗評價中的應用，其特征在于所述的步驟7中，使用單細胞方法測定雙氫青蒿素誘導的免疫細胞亞群的方法，包括細胞捕獲和 cDNA 合成，具體步驟如下：

（1）將所獲得的脾臟單細胞懸浮在含有 0.04% BSA 的 PBS 中；

（2）在芯片的每個通道加入約6,000個細胞，預計回收的目標細胞約為3,000個細胞；

（3）捕獲的細胞被裂解，釋放的 RNA 在單個 GEM 中通過逆轉錄進行條形碼標記;

（4）逆轉錄在 S1000TM Touch Thermal Cycler (Bio Rad) 上在 53°C 下進行 45 分鐘，然后在 85°C，5 分鐘，在結束后保持在 4°C；

生成的cDNA在安捷倫4200分光光度計中確定質量。