[發(fā)明專利]一種生物酶催化制備3,4-二羥基苯乙醇的方法

在審

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• 申請日: 2022-01-17
• 公開（公告）號: CN114350717A
• 公開（公告）日: 2022-04-15
• 發(fā)明（設計）人: 王浩;丁葉;華夏
• 申請（專利權）人: 南京合谷生命生物科技有限公司
• 主分類號: C12P7/22
• 分類號: C12P7/22
• 代理公司: 南京聚匠知識產權代理有限公司 32339
• 代理人: 吳亞東

本發(fā)明公開了一種生物酶催化制備3,4?二羥基苯乙醇的方法，以誘導產酶的大腸桿菌發(fā)酵液為原料，離心獲取菌體，再加入緩沖液使菌體懸浮、通氧等處理，再加入底物對羥基苯乙醇，生物酶催化進行反應，獲得3,4?二羥基苯乙醇。本發(fā)明以對羥基苯乙醇底物，采用生物酶催化，生物合成得到3,4?二羥基苯乙醇，反應條件溫和，無副產物，底物殘留量少；生物酶催化效率高，達到99％，產物3,4?二羥基苯乙醇的產量，達到13g/L以上；本發(fā)明制備方法綠色環(huán)保，反應周期短，可應用于大規(guī)模工業(yè)化生產，滿足市場需求。

技術領域

本發(fā)明涉及一種生物酶催化制備3,4-二羥基苯乙醇的方法，屬于生物工程技術領域。

背景技術

3,4-二羥基苯乙醇，又名羥基酪醇，分子式C₈H₁₀O₃，是一種天然多酚類化合物，發(fā)現(xiàn)于橄欖油和加工橄欖油產生的廢水中，主要是以酯化物橄欖苦苷經(jīng)過水解后可得到游離的3,4-二羥基苯乙醇，研究表明3,4-二羥基苯乙醇具有較強的抗氧化活性，另外，還具有多種生物和藥理活性，可預防骨質疏松，有助于糖尿病、肥胖癥等與線粒體功能失調相關疾病的治療，并可降低該類疾病的發(fā)病率，廣泛用于食品工業(yè)、營養(yǎng)保健和化妝品中。因此，3,4-二羥基苯乙醇的提取和制備具有一定的現(xiàn)實意義和較好的經(jīng)濟效益。

3,4-二羥基苯乙醇，傳統(tǒng)制備方法是從橄欖油或橄欖葉中提取，提取過程中需要用到乙酸乙酯、無水乙醇、二氯甲烷等大量易燃易爆的有機試劑，提取的收率僅有8.4％，收率低，同時在提取過程中會含有較多的副產物，導致對羥基苯乙醇的純度較低；目前常用的制備方法一般是通過合成制備，例如，肖艷、張楊等公開的羥基酪醇的合成方法，報道了以鄰苯二酚和乙醛酸為原料，經(jīng)3,4-二羥基扁桃酸合成3,4-二羥基苯乙醇，通過四步反應合成了3,4-二羥基苯乙醇，總收率為52.7％，收率較低；還有的制備方法是采用生物制備方法，例如，中國專利CN201710659225.1公開的一種工程菌及應用，報道了以L-氨基酸氧化酶，α-酮酸脫羧酶，醇脫氫酶，NAD(P)還原酶四種酶共表達大腸桿菌，生物合成2-苯乙醇、酪醇、羥基酪醇，其中，3,4-二羥基苯乙醇產量為435mg/L，產量較低；中國專利CN201710659225.1公開的表達羥基酪醇和羥基酪醇葡萄糖苷的大腸桿菌及構建方法及應用，報道了構建的大腸桿菌含有并能夠表達ARO10、HpaBC和UGT基因，重組大腸桿菌酪氨酸通過相關基因進行表達，獲得3,4-二羥基苯乙醇，其產量可達401mg/L，產量較低。因此，為提高3,4-二羥基苯乙醇的產量、轉化率，本發(fā)明提供了一種生物酶催化制備3,4-二羥基苯乙醇的方法。

發(fā)明內容

針對上述現(xiàn)有技術存在的問題，本發(fā)明提供一種生物酶催化制備3,4-二羥基苯乙醇的方法，以誘導生產3,4-二羥基苯乙醇的菌株作為生物酶，對羥基苯乙醇作為底物，通過生物酶催化合成3,4-二羥基苯乙醇，催化效率高，無副產物，可用于大規(guī)模工業(yè)化生產。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案：一種生物酶催化制備3,4-二羥基苯乙醇的方法，具體包括以下步驟：

S1、將誘導產酶的大腸桿菌發(fā)酵液進行離心處理，離心轉速為2000～8000rpm/min，離心時間為1～10min，去除離心液，獲得菌體；

S2、向步驟S1的菌體中加入緩沖液，使菌體懸浮，移至四口燒瓶內，然后進行磁力攪拌，攪拌轉速為200～1200rpm/min，并進行水浴加熱，加熱溫度為25～45℃，接著向菌體懸浮液中通入氧氣，實時控制pH；

S3、稱取對羥基苯乙醇底物，并用少量緩沖液進行溶解混合均勻，后分多次加入四口燒瓶分內，并持續(xù)攪拌進行反應，后使用高效液相檢測反應液中的對羥基苯乙醇底物，當反應液內沒有對羥基苯乙醇底物時，停止攪拌并關閉通氣，使反應停止，獲得3,4-二羥基苯乙醇產物的反應液，反應液冷藏保存；

S4、采用高效液相色譜檢測分析步驟S3中反應液中的3,4-二羥基苯乙醇產物，獲得3,4-二羥基苯乙醇的產量，達到13g/L以上，并獲得3,4-二羥基苯乙醇的轉化率，達到99％以上。