[發(fā)明專利]一種血液中轉甲狀腺素蛋白(TTR)四聚體濃度測定的預處理方法和檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210043426.X
• 申請日: 2022-01-14
• 公開（公告）號: CN114324693B
• 公開（公告）日: 2023-01-13
• 發(fā)明（設計）人: 劉宇;曹云峰;崔麗;關麗萍;劉明莉;崔雪婷;高鵬
• 申請（專利權）人: 大連博源醫(yī)學科技有限公司
• 主分類號: G01N30/06
• 分類號: G01N30/06;G01N30/14;G01N30/88;G01N30/86
• 代理公司: 北京中和立達知識產(chǎn)權代理有限公司 11756
• 代理人: 張可

本發(fā)明公開了一種血液中轉甲狀腺素蛋白(TTR)四聚體濃度測定的預處理和檢測方法，包括如下步驟：血液過膜后加入小分子熒光探針，進行孵育，使小分子熒光探針與TTR特異性結合而產(chǎn)生熒光；孵育后的樣本加入稀釋劑進行稀釋、離心、取上清液后，采用高效液相色譜進行分離，利用熒光檢測器進行定量分析。本發(fā)明操作簡便，可實現(xiàn)血液中TTR四聚體濃度的定量測定，并通過TTR總濃度減去TTR四聚體濃度得出TTR錯誤折疊濃度，還可通過保留時間定性鑒別TTR四聚體為野生型或變異型，具有良好的選擇性，精密度和準確度。

技術領域

本發(fā)明屬于分析檢測技術領域，具體地說涉及一種用于檢測血液類樣本中轉甲狀腺素蛋白(TTR)四聚體濃度測定的預處理方法和檢測方法。

背景技術

前白蛋白，也稱轉甲狀腺素蛋白(Transthyretin，簡稱TTR)，是由127個氨基酸組成，分子量為55KDa的四聚體蛋白。它主要由肝臟和大腦的脈絡叢產(chǎn)生，也有少量由視網(wǎng)膜上皮細胞合成，然后分泌到血液和腦脊液中，具有轉運甲狀腺激素、結合RBP蛋白等功能。

通常，TTR由四個相同的單體組成，在ATTR淀粉樣變性(ATTRAmyloidosis)中，四聚體蛋白的穩(wěn)定性下降，蛋白質分解成二聚體和單體，呈現(xiàn)出部分展開的構象，并自組裝成有毒的非原纖維聚集體，后來變成淀粉樣蛋白原纖維。這些淀粉樣化蛋白沉積在周邊神經(jīng)系統(tǒng)和心肌等組織，進而引發(fā)淀粉樣多發(fā)性神經(jīng)病(ATTR-PN)和淀粉樣變心肌病(ATTR-CM)。

ATTR淀粉樣變性分為兩種類型：遺傳型(家族型)ATTR淀粉樣變性(hATTR)。此種類型的ATTR淀粉樣變?yōu)轱@性遺傳病。迄今為止，文獻報道中已經(jīng)描述了TTR基因上的140多種突變(Connors,L.H.；Lim,A.；Prokaeva,T.；Roskens,V.A.；Costello,C.E.,Tabulation ofhuman transthyretin(TTR)variants,2003.Amyloid 2003,10(3),160-84)。野生型(wtATTR)ATTR淀粉樣變性與遺傳型ATTR淀粉樣變性不同，野生型不涉及異常DNA，也不能遺傳給家庭成員。相反，隨著年齡的增長，正常的TTR蛋白變得不穩(wěn)定，更易發(fā)生錯誤折疊并形成淀粉樣原纖維(Sekijima,Y.,Transthyretin(ATTR)amyloidosis:clinical spectrum,molecularpathogenesis and disease-modifying treatments.J Neurol NeurosurgPsychiatry 2015,86(9),1036-43))。

此外，ATTR還會導致患者的其他器官受累。其中，手臂受到影響的癥狀包括：腕管綜合癥、麻木，灼痛和/或刺痛(周圍神經(jīng)病變)、二頭肌腱斷裂；背部受到影響的癥狀包括：腰椎管狹窄癥；腿部受到影響的癥狀包括：腳或腿腫脹、麻木，灼痛和/或刺痛(周圍神經(jīng)病變)、腿無力；頭部和頸部受到影響的癥狀包括：眼部漂浮物(玻璃狀混濁)、站立時頭昏眼花；心臟和肺部受到影響的癥狀包括：氣促、心悸、胸痛、疲勞；胃或腸受到影響的癥狀包括：沒胃口、脹氣腹瀉或便秘。由于該疾病的高度受累率，ATTR通常會極大地影響患者的生活質量，獨立性和預期壽命。如果不加以治療，診斷后的預期壽命為2至5年。

目前，免疫濁度法是進行血液中TTR濃度測定的常用方法。該方法測定的是血液中總的 TTR濃度，包括TTR單體、二聚體、四聚體，是這三種濃度之和，不能特異性對TTR四聚體的濃度進行單獨測定，也無法獲得錯誤折疊的TTR的量，更無法區(qū)分TTR四聚體類型。因此迫切需要開發(fā)一種準確精密且特異性強的血液中TTR四聚體的檢測方法。

發(fā)明內容