[發(fā)明專利]基于酶DNA修復(fù)級(jí)聯(lián)驅(qū)動(dòng)熒光團(tuán)編碼/去編碼的生物傳感器及其在端粒酶檢測(cè)中的應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210043048.5
• 申請(qǐng)日: 2022-01-14
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN114507706A
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-05-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張春陽(yáng);劉明昊;于宛彤
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東師范大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/48
• 分類號(hào): C12Q1/48;C12Q1/682;C12Q1/6825
• 代理公司: 濟(jì)南圣達(dá)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 37221
• 代理人: 宋海海

本發(fā)明提供基于酶DNA修復(fù)級(jí)聯(lián)驅(qū)動(dòng)熒光團(tuán)編碼/去編碼的生物傳感器及其在端粒酶檢測(cè)中的應(yīng)用，屬于熒光檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。所述生物傳感器至少包括AP探針，TS引物，無(wú)嘌呤/無(wú)嘧啶核酸內(nèi)切酶(APE1)，熒光基團(tuán)修飾的dATP，末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)以及鏈霉親和素包被的磁珠。采用本發(fā)明生物傳感器進(jìn)行端粒酶檢測(cè)，可以有效防止非特異性擴(kuò)展，降低背景信號(hào)，使用基于全內(nèi)反射熒光(TIRF)的單分子檢測(cè)進(jìn)行定量，可以實(shí)現(xiàn)在單細(xì)胞水平靈敏檢測(cè)端粒酶，從而使其在早期臨床診斷和抗癌藥物開(kāi)發(fā)等方面具有巨大潛力，因此具有良好的實(shí)際應(yīng)用之價(jià)值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于熒光檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及基于酶DNA修復(fù)級(jí)聯(lián)驅(qū)動(dòng)熒光團(tuán)編碼/去編碼的生物傳感器及其在端粒酶檢測(cè)中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

本發(fā)明背景技術(shù)中公開(kāi)的信息僅僅旨在增加對(duì)本發(fā)明的總體背景的理解，而不必然被視為承認(rèn)或以任何形式暗示該信息構(gòu)成已經(jīng)成為本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所公知的現(xiàn)有技術(shù)。

端粒是位于染色體末端的特殊的非編碼串聯(lián)DNA重復(fù)序列(TTAGGG)n結(jié)構(gòu)，隨著細(xì)胞的分裂逐漸縮短，會(huì)導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定和細(xì)胞衰老。人類端粒酶是一種重要的核糖核蛋白，通過(guò)在端粒的3′端添加端粒重復(fù)序列5-(TTAGGG)n來(lái)維持端粒長(zhǎng)度和細(xì)胞分裂潛能。端粒酶由人端粒酶RNA(hTER)、端粒酶相關(guān)蛋白(hTEP1)和人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)組成，其中hTERT在端粒酶的合成功能中起著決定性作用，是端粒酶活性的限制因素。在大多數(shù)人體細(xì)胞中，端粒酶的表達(dá)水平極低，但是在癌細(xì)胞中，例如胃癌、肺癌和肝癌等超過(guò)85％的癌細(xì)胞，端粒酶具有很高的表達(dá)，由于端粒酶活性在正常體細(xì)胞和癌細(xì)胞之間存在顯著差異，端粒酶已被視為早期癌癥診斷和預(yù)測(cè)的重要生物標(biāo)志物。同時(shí)，隨著端粒酶抑制劑和靶向抗癌劑的發(fā)展，抑制端粒酶活性被認(rèn)為是一種很有前途的癌癥治療方法。因此，準(zhǔn)確、快速、靈敏地檢測(cè)端粒酶活性對(duì)生物醫(yī)學(xué)研究、臨床診斷和癌癥治療具有重要意義。

近幾十年來(lái)，端粒酶檢測(cè)方法層出不窮，其中最經(jīng)典的方法是基于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的端粒重復(fù)序列擴(kuò)增方案(TRAP)，它廣泛用于端粒酶活性的高靈敏度檢測(cè)。然而，這個(gè)經(jīng)典的方法具有程序復(fù)雜、聚合酶活性受到細(xì)胞提取物的干擾以及無(wú)法避免的產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增的缺點(diǎn)。

為了優(yōu)化復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)程序，人們開(kāi)發(fā)出了一些比經(jīng)典方法更簡(jiǎn)單的檢測(cè)端粒酶的方法，如：基于DNA鑷子的熒光法、基于鏈位移的比率熒光法、基于氧化石墨烯的熒光法和基于單分散金納米棒的電化學(xué)生物傳感器。這些方法不僅能夠更加快速簡(jiǎn)便的檢測(cè)端粒酶，而且一些方法還具有能夠確定端粒酶反應(yīng)產(chǎn)物長(zhǎng)度分布或同時(shí)檢測(cè)端粒酶和其他生物標(biāo)記物的優(yōu)勢(shì)。然而，這些分析方法涉及繁瑣的納米材料合成、復(fù)雜的探針設(shè)計(jì)，并且由于缺乏信號(hào)放大過(guò)程，因此這些方法的靈敏度不令人滿意。

為了提高靈敏度，人們開(kāi)發(fā)出了一系列與信號(hào)放大策略相結(jié)合的方法，如：催化發(fā)夾組裝(CHA)、指數(shù)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)(EXPAR)、核酸外切酶輔助信號(hào)擴(kuò)增(EASA)、滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)和雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(HCR)。這些方法改善了之前方法所存在的不足，具有良好的靈敏度和特異性，但是這些方法依賴于嚴(yán)格的序列要求、溫和的反應(yīng)條件和復(fù)雜的表面改性過(guò)程。此外，值得注意的是聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)、指數(shù)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)(EXPAR)是模板依賴性擴(kuò)增，而核酸外切酶輔助信號(hào)擴(kuò)增(EASA)、催化發(fā)夾組裝(CHA)以及雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(HCR)依賴于DNA探針序列，它們的擴(kuò)增過(guò)程也表現(xiàn)出模板依賴性，這導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增產(chǎn)生的擴(kuò)增子交叉污染產(chǎn)生不可避免的假陽(yáng)性信號(hào)。因此，開(kāi)發(fā)一種用于端粒酶檢測(cè)的具有高靈敏度和低模板依賴性的簡(jiǎn)單信號(hào)放大分析方法成為本領(lǐng)域研究人員亟待解決的問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本發(fā)明提供一種基于酶DNA修復(fù)級(jí)聯(lián)驅(qū)動(dòng)熒光團(tuán)編碼/去編碼的生物傳感器及其在端粒酶檢測(cè)中的應(yīng)用。本發(fā)明基于端粒定向級(jí)聯(lián)DNA修復(fù)介導(dǎo)的熒光團(tuán)編碼/解碼，開(kāi)發(fā)一種用于敏感檢測(cè)端粒酶的模板獨(dú)立的生物傳感器以及相應(yīng)單分子分析方法，從而有效防止非特異性擴(kuò)展，降低背景信號(hào)，使用基于全內(nèi)反射熒光(TIRF)的單分子檢測(cè)進(jìn)行定量，從而可以實(shí)現(xiàn)在單細(xì)胞水平靈敏檢測(cè)端粒酶，因此具有良好的實(shí)際應(yīng)用之價(jià)值。