[發(fā)明專利]基于酶DNA修復(fù)級(jí)聯(lián)驅(qū)動(dòng)熒光團(tuán)編碼/去編碼的生物傳感器及其在端粒酶檢測(cè)中的應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210043048.5
• 申請(qǐng)日: 2022-01-14
• 公開（公告）號(hào): CN114507706A
• 公開（公告）日: 2022-05-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張春陽;劉明昊;于宛彤
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東師范大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/48
• 分類號(hào): C12Q1/48;C12Q1/682;C12Q1/6825
• 代理公司: 濟(jì)南圣達(dá)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 37221
• 代理人: 宋海海

1.一種基于酶DNA修復(fù)級(jí)聯(lián)驅(qū)動(dòng)熒光團(tuán)編碼/去編碼的生物傳感器，其特征在于，所述生物傳感器至少包括AP探針，TS引物，無嘌呤/無嘧啶核酸內(nèi)切酶，熒光基團(tuán)修飾的dATP，末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶以及鏈霉親和素包被的磁珠；

其中，所述AP探針為一個(gè)單鏈的DNA，所述AP探針含有無嘌呤/無嘧啶位點(diǎn)；且所述AP探針可以與端粒酶延伸產(chǎn)物完全雜交形成包含AP位點(diǎn)的雙鏈DNA，而與未能發(fā)生反應(yīng)的TS引物只會(huì)部分雜交。

2.如權(quán)利要求1所述的生物傳感器，其特征在于，所述AP探針5'末端和3'末端分別修飾有生物素和磷酸基團(tuán)；

優(yōu)選的，所述AP探針長(zhǎng)度為30nt，所述AP探針的堿基序列為:5'-Biotin-CCTCCC TAAXCC TAA CTC TGC TCG ACG GAT-PO₄-3'，其中下劃線標(biāo)出的堿基序列即為磁珠捕獲的后續(xù)進(jìn)行TdT擴(kuò)增的序列，下劃線標(biāo)出的X即無嘌呤/無嘧啶位點(diǎn)。

3.如權(quán)利要求1所述的生物傳感器，其特征在于，所述熒光基團(tuán)修飾的dATP中，所述熒光基團(tuán)為Cy5；

優(yōu)選的，所述Cy5 dATPs在總dATPs中占比少于50％，進(jìn)一步少于30％，優(yōu)選為20％。

4.如權(quán)利要求1所述的生物傳感器，其特征在于，所述生物傳感器還包括核酸外切酶，優(yōu)選為核酸外切酶I。

5.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述生物傳感器在檢測(cè)端粒酶中的應(yīng)用。

6.一種檢測(cè)端粒酶的方法，其特征在于，所述方法包括采用權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述生物傳感器進(jìn)行檢測(cè)。

7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法包括：

S1、將待測(cè)樣品加入反應(yīng)溶液I中，進(jìn)行端粒酶延伸以及酶切反應(yīng)，然后高溫滅活處理并進(jìn)行磁珠捕獲，構(gòu)建MB單鏈DNA納米結(jié)構(gòu)；

S2、向步驟S1制得的MB單鏈DNA納米結(jié)構(gòu)中加入TdT酶，dATPs和熒光基團(tuán)修飾的dATP，進(jìn)行延伸反應(yīng)，得到熒光基團(tuán)標(biāo)記的多尾單鏈DNA鏈；

S3、向步驟S2中熒光基團(tuán)標(biāo)記的多尾單鏈DNA鏈中加入核酸外切酶進(jìn)行反應(yīng)；

優(yōu)選的，所述步驟S1中，反應(yīng)溶液I中至少包括TS引物、APE1酶和AP探針；

進(jìn)一步優(yōu)選的，所述反應(yīng)溶液I中還可以包括dNTPs、RNA酶抑制劑以及反應(yīng)buffer等，從而有助于反應(yīng)的順利進(jìn)行；

優(yōu)選的，端粒酶延伸以及酶切反應(yīng)具體反應(yīng)條件為：在30-45℃(優(yōu)選為37℃)，反應(yīng)30-60min(優(yōu)選為30min)；高溫滅活的溫度為60℃以上，優(yōu)選為65℃；

優(yōu)選的，所述磁珠為鏈霉親和素包被的磁珠，磁珠使用濃度控制為1-10mg mL^-1，優(yōu)選為5mg mL^-1；

優(yōu)選的，所述步驟S2中，延伸反應(yīng)具體條件為：在30-45℃(優(yōu)選為37℃)，反應(yīng)0.5-2h(優(yōu)選為1h)；

優(yōu)選的，所述步驟S3中，反應(yīng)具體條件為：在30-45℃(優(yōu)選為37℃)，反應(yīng)10-60min(優(yōu)選為15min)；

8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法還包括對(duì)步驟S3獲得的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)分析；優(yōu)選的，所述檢測(cè)分析包括熒光檢測(cè)分析和單分子成像檢測(cè)分析。

優(yōu)選的，待測(cè)樣品是生物樣品，所述生物樣品包括離體的血液、體液、組織和細(xì)胞。

9.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述生物傳感器和/或權(quán)利要求6-8任一項(xiàng)所述檢測(cè)方法在端粒酶相關(guān)藥物篩選和/或生物樣品端粒酶檢測(cè)分析中的應(yīng)用。

10.如權(quán)利要求9所述應(yīng)用，其特征在于，所述端粒酶相關(guān)藥物包括端粒酶促進(jìn)劑和端粒酶抑制劑；

所述生物樣品包括離體的血液、體液、組織和細(xì)胞。