[發明專利]一種基于微流控芯片的人腎小球內皮細胞培養及其藥物檢測毒性評價方法

在審

• 申請號: 202210043005.7
• 申請日: 2022-01-14
• 公開（公告）號: CN114317411A
• 公開（公告）日: 2022-04-12
• 發明（設計）人: 楊倬;秦文;霍軍生;陳頔;殷繼永;黃建;樸瑋;王晶波;王麗媛;卓勤;宮照龍
• 申請（專利權）人: 中國疾病預防控制中心營養與健康所
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12Q1/26;C12Q1/02;G01N21/31;G01N1/30;G01N33/68;B01L3/00
• 代理公司: 北京市合德專利事務所 11244
• 代理人: 王文會;劉榜美

1.一種基于微流控芯片的人腎小球內皮細胞培養方法，其特征在于，所述培養方法包括：

步驟一，芯片預處理

將微流控細胞芯片、芯片蓋板進行滅菌處理，并準備膠墊清潔滅菌超靜干燥后置于微流控細胞芯片備用；

所述步驟一中微流控細胞芯片上設置有進液孔1-6列，排液孔7列、8列，將孔內保濕液吸出，并向孔1-8內灌注PBS緩沖液，之后將1-8號孔內的PBS緩沖液吸棄，再次將1-6號孔內加入PBS緩沖液300-350ul，密封后室溫靜置30-40min，最后將微流控細胞芯片和芯片蓋板蓋合后對微流控細胞芯片進行沖洗，之后放置備用；

步驟二，細胞接種

將所述微流控細胞芯片的6號孔中液體排空，之后向6號孔內加入人腎小球內皮細胞溶液10-15ul，濃度為1-5x10⁶cells/ml；

將1號孔中加入含血清的培養基350ul；

向微流控細胞芯片施以0.25psi,8秒的加壓條件，完成細胞向培養室的注入工作。

步驟三，細胞培養

以37℃、5％CO₂氣體濃度的條件對步驟二完成細胞注入工作的微流控細胞芯片進行培養，此時1號孔向培養基通過重力自然持續灌流，細胞進行貼壁培養24h后備用。

2.根據權利要求1中所述的基于微流控芯片的人腎小球內皮細胞培養方法，其特征在于，所述步驟二中向6號孔內加入的人腎小球內皮細胞溶液濃度為2x10⁶cells/ml。

3.根據權利要求1中所述的基于微流控芯片的人腎小球內皮細胞培養方法，其特征在于，所述步驟二中人腎小球內皮細胞溶液的加入量為15ul。

4.一種使用權利要求1-3中培育的人腎小球內皮細胞藥物檢測毒性評價方法，其特征在于，該評價方法包括下列步驟：

步驟A：檢測準備，將1號、2號孔中液體吸干，在2號孔中加入受試物350ul進行干預，將2號孔進樣壓力設定為0.5-1psi，以37℃、5％CO₂氣體濃度的條件下持續培養48h后進行毒性指標檢測；

步驟B：檢測LDH濃度，將步驟一中獲得的細胞培養液進行收集，將細胞培養液置于LDH試劑盒，檢測LDH濃度，記錄檢測結果；

步驟C：活性檢測，加入CCK-8檢測工作液，以3psi、37℃、5％CO₂氣體濃度的條件進行孵育1-4h，將產物轉入細胞培養板中，將細胞培養板置于酶標儀待檢，酶標儀吸光度設定為450nm，檢測，記錄檢測結果。

5.根據權利要求4中所述的基于微流控芯片的人腎小球內皮細胞藥物檢測毒性評價方法，其特征在于，所述步驟A中受試物在加入2號孔前進行離心處理。

6.根據權利要求4中所述的基于微流控芯片的人腎小球內皮細胞藥物檢測毒性評價方法，其特征在于，所述步驟A中受試物在加入2號孔前進行過濾處理。

7.根據權利要求4中所述的基于微流控芯片的人腎小球內皮細胞藥物檢測毒性評價方法，其特征在于，所述步驟C中檢測孵育時間為4h。

8.根據權利要求4中所述的基于微流控芯片的人腎小球內皮細胞藥物檢測毒性評價方法，其特征在于，該藥物腎毒性評價方法還包括：活死細胞染色，將步驟A中細胞加入活死細胞染料，調節微流控芯片壓力為2-3psi，染色30min后進行熒光觀察，記錄觀察結果。

9.根據權利要求4中所述的基于微流控芯片的人腎小球內皮細胞藥物檢測毒性評價方法，其特征在于，該藥物腎毒性評價方法還包括：免疫熒光染色，將步驟A中細胞加入4％甲醛固定細胞，封閉后加一抗和二抗孵育后進行熒光觀察，記錄觀察結果。

10.根據權利要求9中所述的基于微流控芯片的人腎小球內皮細胞藥物檢測毒性評價方法，其特征在于，所述一抗濃度為1:50。