[發(fā)明專利]一種基于微流控芯片的人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)及其藥物檢測毒性評(píng)價(jià)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210043005.7
• 申請(qǐng)日: 2022-01-14
• 公開（公告）號(hào): CN114317411A
• 公開（公告）日: 2022-04-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊倬;秦文;霍軍生;陳頔;殷繼永;黃建;樸瑋;王晶波;王麗媛;卓勤;宮照龍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國疾病預(yù)防控制中心營養(yǎng)與健康所
• 主分類號(hào): C12N5/071
• 分類號(hào): C12N5/071;C12Q1/26;C12Q1/02;G01N21/31;G01N1/30;G01N33/68;B01L3/00
• 代理公司: 北京市合德專利事務(wù)所 11244
• 代理人: 王文會(huì);劉榜美

本發(fā)明涉及一種基于微流控芯片的人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)及其藥物檢測毒性評(píng)價(jià)方法，具體培養(yǎng)方法包括：使用微流控細(xì)胞芯片分析儀進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)、試驗(yàn)，具體步驟包括：步驟一，芯片預(yù)處理；步驟二，細(xì)胞接種；步驟三，細(xì)胞培養(yǎng)；在完成細(xì)胞培養(yǎng)后，將培養(yǎng)成功的細(xì)胞用于后續(xù)藥物評(píng)價(jià)性檢測，具體步驟包括：步驟一：檢測準(zhǔn)備；步驟二：檢測LDH濃度；步驟三：活性檢測；并且還可以使用活死細(xì)胞染色、免疫熒光檢測以及炎癥細(xì)胞因子檢測，通過實(shí)施上述步驟操作，精確調(diào)控細(xì)胞生長區(qū)域的溫度和氣體成分，擺脫了外置培養(yǎng)箱，實(shí)現(xiàn)顯微鏡下對(duì)細(xì)胞的長期持續(xù)觀察，微流控細(xì)胞模型能夠更好的模擬人體微環(huán)境，進(jìn)行藥物評(píng)價(jià)效果更為精準(zhǔn)。

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)及藥物毒性檢測評(píng)價(jià)領(lǐng)域，尤其涉及一種基于微流控芯片的人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)及其藥物檢測毒性評(píng)價(jià)方法。

背景技術(shù)

現(xiàn)有的體外毒理學(xué)評(píng)價(jià)模型預(yù)測能力較差，這在很大程度上阻礙了醫(yī)藥研發(fā)的進(jìn)程，建立和發(fā)展可靠的體外毒理學(xué)評(píng)價(jià)替代模型可以有效提升評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，但現(xiàn)有的要通過包括動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、體外實(shí)驗(yàn)等一系列毒理學(xué)評(píng)價(jià)手段來確定其藥效及安全性或其評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)，現(xiàn)有技術(shù)還沒有建立仿人體環(huán)境人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞模型相關(guān)研究，導(dǎo)致臨床前模型的缺乏和其較差的預(yù)測能力導(dǎo)致了大量藥物在臨床試驗(yàn)中的失敗和開發(fā)新藥的成本上升，可靠的體外毒理學(xué)評(píng)價(jià)替代模型并且仿人體環(huán)境進(jìn)行培養(yǎng)是醫(yī)藥研發(fā)領(lǐng)域面臨的迫切需求。

發(fā)明內(nèi)容

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明公開了一種基于微流控芯片的人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)及其藥物檢測毒性評(píng)價(jià)方法，所述培養(yǎng)方法包括：

步驟一，芯片預(yù)處理

將微流控細(xì)胞芯片、芯片蓋板進(jìn)行滅菌處理，并準(zhǔn)備膠墊清潔滅菌超靜干燥后置于微流控細(xì)胞芯片備用；

所述步驟一中微流控細(xì)胞芯片上設(shè)置有進(jìn)液孔1-6列，排液孔7列、8列，將孔內(nèi)保濕液吸出，并向孔1-8內(nèi)灌注PBS緩沖液，之后將1-8號(hào)孔內(nèi)的PBS緩沖液吸棄，再次將1-6號(hào)孔內(nèi)加入PBS緩沖液300-350ul，密封后室溫靜置30-40min，最后將微流控細(xì)胞芯片和芯片蓋板蓋合后對(duì)微流控細(xì)胞芯片進(jìn)行沖洗，之后放置備用；

步驟二，細(xì)胞接種

將所述微流控細(xì)胞芯片的6號(hào)孔中液體排空，之后向6號(hào)孔內(nèi)加入人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞溶液10-15ul，濃度為1-5x10⁶cells/ml；

將1號(hào)孔中加入含血清的培養(yǎng)基350ul；

向微流控細(xì)胞芯片施以0.25psi,8秒的加壓條件，完成細(xì)胞向培養(yǎng)室的注入工作。

步驟三，細(xì)胞培養(yǎng)

以37℃、5％CO₂氣體濃度的條件對(duì)步驟二完成細(xì)胞注入工作的微流控細(xì)胞芯片進(jìn)行培養(yǎng)，此時(shí)1號(hào)孔向培養(yǎng)基通過重力自然持續(xù)灌流，細(xì)胞進(jìn)行貼壁培養(yǎng)24h后備用。

進(jìn)一步的，所述步驟二中向6號(hào)孔內(nèi)加入的人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞溶液濃度為2x10⁶cells/ml。

進(jìn)一步的，所述步驟二中人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞溶液的加入量為15ul。

一種使用微流控芯片培育的人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞藥物檢測毒性評(píng)價(jià)方法，該評(píng)價(jià)方法包括下列步驟：

步驟A：檢測準(zhǔn)備，將1號(hào)、2號(hào)孔中液體吸干，在2號(hào)孔中加入受試物350ul進(jìn)行干預(yù)，將2號(hào)孔進(jìn)樣壓力設(shè)定為0.5-1psi，以37℃、5％CO₂氣體濃度的條件下持續(xù)培養(yǎng)48h后進(jìn)行毒性指標(biāo)檢測；

步驟B：檢測LDH濃度，將步驟一中獲得的細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行收集，將細(xì)胞培養(yǎng)液置于LDH試劑盒，檢測LDH濃度，記錄檢測結(jié)果；