[發明專利]一株抗病促生草莓生物菌及生物有機肥制備方法

在審

• 申請號: 202210042466.2
• 申請日: 2022-01-14
• 公開（公告）號: CN115925469A
• 公開（公告）日: 2023-04-07
• 發明（設計）人: 姚燕來;楊肖芳;朱為靜;洪磊東;洪春來;朱鳳香;王衛平
• 申請（專利權）人: 浙江省農業科學院
• 主分類號: C05G3/00
• 分類號: C05G3/00;C05G3/60;C05G3/80;C12N1/20;C12N1/02;C12R1/07
• 代理公司: 杭州君度專利代理事務所(特殊普通合伙) 33240
• 代理人: 沈志良

1.一種抗病促生草莓生物菌，其特征在于所述的抗病促生草莓生物菌為解淀粉孢桿菌(Bacillus?amyloliquefaciens)，已于2020年5月21日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號為CGMCCNo.19859。

2.根據權利要求1所述的一種抗病促生草莓生物菌的應用，其特征在于所述的抗病促生草莓生物菌應用于肥料中，所述的肥料為微生物肥料。

3.根據權利要求1所述的一種抗病促生草莓生物菌分離篩選方法，其特征在于所述的分離篩選方法至少包括如下步驟：

(1)土壤樣品的采集與根際功能微生物的分離

采集溫州蒼南縣馬站鎮設施種植大棚發病區塊內健壯的植株，輕輕帶土拔出植株，帶回實驗室用于抗病促生菌株的分離篩選，采集時間為2019年。分離篩選時，輕輕抖落植株根系上松散的附著土，將植株自根莖處剪斷，稱取10g帶根際土的植物根系，置于盛有滅菌玻璃珠和90mL無菌水的錐形瓶中，28℃、170r·min^-1振蕩30min，得到懸浮液，按照梯度濃度稀釋，涂布于LB培養基上，選擇10^－4、10^－5、10^－6三個梯度進行涂布，每個梯度三次重復，恒溫培養箱中在28℃下，倒置培養18h，挑取生長迅速、不同形態的單菌落于新的平板上，劃線純化3-4次，分別編號，挑取菌落加入體積分數為15％的滅菌甘油于-80℃保藏待用；

(2)拮抗功能微生物的篩選

采用平板對峙法，以尖孢鐮刀菌作為目標病原菌株，將病原菌接種到PDA平板中，同時在平板四周接種分離到的根際微生物，通過比較抑菌圈的大小，篩選具有高效抗病的功能微生物菌株；

(3)功能微生物的鑒定

利用16S?rDNA測序技術對獲得功能微生物進行鑒定，PCR擴增16S?rDNA片段的引物為一對通用引物，正向引物BSF8/20：5'-AGAGT?TTGAT?CCTGG?CTCAG-3'；反向引物BSR1541/20：5'-AAGGA?GGTGA?TCCAG?CCGCA-3'；PCR反應體系為：10×PCR緩沖液5.0μl，MgCl2?25mM3.0μl，dNTP?4.0μl，引物BSF8/20和引物BSR1541/20各1.0μl，模板DNA?1.0μl，Taq酶10000U/mL?0.25μl，重蒸水36.0μl。PCR程序如下：(1)94℃5min；(2)94℃1min，55℃1min，72℃1.5min，第2步循環35次；(3)72℃10min；(4)4℃10min；PCR擴增16S?rDNA序列經測序后，在NCBI網站上進行比對，獲得菌株的分類信息；

(4)拮抗功能微生物的分離

為了篩選獲得具有高效拮抗作用的功能微生物，將前期從健康植株根部分離到的根際微生物接種到斜面培養基上進行培養，累計獲得具有不同形態的微生物13株，培養后將其接種到中間接種有尖孢鐮刀菌的PDA培養基平板上，進行對峙試驗，在培養箱培養后，觀察抑菌圈的大小，選擇抑菌圈較大的菌株用于進一步驗證和純化，得到的結果是：分離的菌株中KS12具有顯著的抑制圈，表明其抑菌活性較強，用于進一步的進行鑒定和功能驗證，同時根據實驗室菌株保藏要求，將該分離的菌株KS12，命名為WSW1；

(5)菌株WSW1的鑒定

菌株的鑒定采用通用引物擴增菌株WSW1的16S?rDNA序列，序列在RDP網站上進行了序列比對，經比對后與Bacillus?amyloliquefaciens的相似性最高，將其命名為Bacillusamyloliquefaciens?WSW1。

4.根據權利要求1所述的一種抗病促生草莓生物菌劑的制備方法，其特征在于所述的制備方法如下：

(1)菌株WSW1生物菌劑的制備

拮抗菌菌劑制備：將低溫冰箱保藏的菌株WSW1接種到LB斜面上進行活化，將活化后的斜面菌種，接種到LB液體培養基中，在30℃的搖床中，以150rpm的轉速下振蕩培養3天，形成具有大量芽孢的菌劑，即獲得拮抗菌菌劑。

(2)、抗病促生混合菌劑的制備

為提高抗病促生作用，將所述拮抗功能微生物菌株WSW1制備的菌劑與阿氏芽孢桿菌制備的菌劑按照1:1的體積比混合即得到抗病促生混合菌劑。

(3)、生物有機肥的制備

將制備好的WSW1菌劑，按照1％的比例添加到經過充分腐熟的豬糞有機肥中，經過充分攪拌后，制備而成生物有機肥，其中用于生物有機肥制備的豬糞有機肥由豬糞和木屑或者秸稈按照4:1的比例經過高溫發酵制備而成，高溫發酵即堆肥溫度55℃的時間應不小于30天，發酵結束后接種之前應該進行堆肥pH的測定，pH應在5.5-7.5之間。