[發明專利]一種獨特基因缺失組合的PRVΔgE/TK/UL56/US3四基因缺失株及其應用

在審

• 申請號: 202210040368.5
• 申請日: 2022-01-14
• 公開（公告）號: CN114350620A
• 公開（公告）日: 2022-04-15
• 發明（設計）人: 陳陸;鄧夢夢;王永生;杜季梅;丁晨夢;楊霞;王新衛;高冬生;郭占達;王川慶
• 申請（專利權）人: 河南農業大學
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N7/04;C12N15/38;C12N15/85;C12N15/90;C12N15/65;A61K39/245;A61P31/22;C12R1/93
• 代理公司: 鄭州大通專利商標代理有限公司 41111
• 代理人: 高為寶

本發明屬于基因工程技術和病毒學技術領域，具體涉及一種獨特基因缺失組合的PRVΔgE/TK/UL56/US3四基因缺失株及其應用。該四基因缺失株是通過缺失偽狂犬病病毒的gE基因、TK基因、UL56基因和US3基因后得到的，具體是先制備PRVΔgE/TK/UL56三基因缺失株，然后通過同源重組技術、Cre?LoxP系統，在PRVΔgE/TK/UL56三基因缺失株的基礎上缺失毒力基因US3，獲得PRVΔgE/TK/UL56/US3四基因缺失株。本發明的四基因缺失毒株可作為弱毒活疫苗，免疫仔豬后未出現PRV臨床癥狀，具有良好的安全性，且能夠對PRV強毒的攻擊提供完全保護。

技術領域

本發明屬于基因工程技術和病毒學技術領域，具體涉及采用同源重組技術、Cre-LoxP系統構建PRVΔgE/TK/UL56/US3四基因缺失株，還涉及該基因缺失毒株在防控豬偽狂犬病中作為疫苗的應用。

背景技術

偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)屬于皰疹病毒科(Herpesviridae)α皰疹病毒亞科(Alpha Herpesririnae)。豬是其自然宿主，可引起妊娠母豬流產、種豬不育、新生仔豬腹瀉和神經系統癥狀。機體耐過PRV急性感染后，其病毒顆粒可在宿主三叉神經節建立長期潛伏感染而終身帶毒。當受到外界應激或刺激時，體內潛伏的病毒粒子可重新被激活，造成復發性感染。該病目前尚無有效的藥物可以進行治療，疫苗免疫接種仍是預防和控制該病發生和流行的主要措施。隨著PRV基因缺失疫苗(Bartha-K61)的引入接種使用加上科學嚴格的規模化養殖，使得該病在一定程度上得以控制。

PRV基因組是雙鏈線性DNA，約143kb，含有70個開放閱讀框，具有很強的遺傳穩定性。GC含量高達70％以上，是皰疹病毒中GC含量最高的。基因組由一個長的獨特區域(UL)、一個短的獨特區域(US)及位于US兩側的內部重復序列(IRS)、末端重復序列(TRL)組成。病毒基因組至少包括70個基因，可以編碼70至100種病毒蛋白，其中多數基因是病毒復制非必需的。病毒增殖必需的糖蛋白主要有gL、gD、gB、gK、gH；非必需糖蛋白主要包括gG、gE、gC、gI、gM和gN等。PRV毒力受多個基因編碼蛋白的影響，如gE、gC、gI、gD、gB、gH、TK、PK及RR等，缺失這些基因可以顯著降低PRV毒力。

隨著分子生物學的發展，對PRV基因組研究不斷的深入，更進一步了解基因組結構對病毒生物學性質和免疫原性的影響，第二代弱毒活疫苗--基因缺失疫苗應運而生。豬偽狂犬基因缺失疫苗其優勢主要表現在：基因缺失疫苗穩定，不易發生毒力返祖增強；PRV基因缺失株毒力低，免疫原性強，保護時間長；可用于疫苗免疫動物與自然感染動物的鑒別診斷。

公開號為CN 110699329 A的中國發明專利申請，公開了基因缺失的減毒偽狂犬病病毒，其是通過基因工程手段將原始毒株的Us3基因序列，以及任選的包含Us區域的其他基因、gE、gI、和/或TK基因缺失以制備基因缺失減毒偽狂犬病病毒。該專利申請并未涉及UL56基因的缺失。

發明內容

本發明通過缺失偽狂犬病病毒的gE、TK、UL56和US3基因，制備了一種免疫效力更強、安全性更高的新型基因缺失疫苗株PRVΔgE/TK/UL56/US3，進而有效防控和根除偽狂犬病。

本發明的豬偽狂犬病病毒基因缺失株，是通過缺失偽狂犬病病毒的gE基因、TK基因、UL56基因和US3基因后得到的PRVΔgE/TK/UL56/US3四基因缺失株。

具體的，本發明的PRVΔgE/TK/UL56/US3四基因缺失株，是先制備PRVΔgE/TK/UL56三基因缺失株，然后通過同源重組技術、Cre-LoxP系統，在PRVΔgE/TK/UL56三基因缺失株的基礎上缺失毒力基因US3，獲得PRVΔgE/TK/UL56/US3四基因缺失株，其制備方法具體包括以下步驟：

(1)PRVΔgE/TK/UL56三基因缺失株的構建：