[發(fā)明專利]一種獨(dú)特基因缺失組合的PRVΔgE/TK/UL56/US3四基因缺失株及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210040368.5
• 申請日: 2022-01-14
• 公開（公告）號: CN114350620A
• 公開（公告）日: 2022-04-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳陸;鄧夢夢;王永生;杜季梅;丁晨夢;楊霞;王新衛(wèi);高冬生;郭占達(dá);王川慶
• 申請（專利權(quán)）人: 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N7/04;C12N15/38;C12N15/85;C12N15/90;C12N15/65;A61K39/245;A61P31/22;C12R1/93
• 代理公司: 鄭州大通專利商標(biāo)代理有限公司 41111
• 代理人: 高為寶

1.一種豬偽狂犬病病毒基因缺失毒株，其特征在于，所述基因缺失毒株為缺失了gE基因、TK基因、UL56基因和US3基因的四基因缺失株P(guān)RVΔgE/TK/UL56/US3。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種豬偽狂犬病病毒基因缺失毒株，其特征在于，所述PRVΔgE/TK/UL56/US3的保藏編號為：CGMCC No.22936。

3.權(quán)利要求1所述的豬偽狂犬病病毒基因缺失毒株的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)PRVΔgE/TK/UL56三基因缺失株的構(gòu)建：

轉(zhuǎn)移載體pSK-UL56-LR-EGFP構(gòu)建：擴(kuò)增PRV UL56基因左右側(cè)基因序列作為同源重組的UL56基因左右側(cè)同源臂，擴(kuò)增EGFP熒光蛋白序列作為標(biāo)記基因，將UL56基因左右側(cè)同源臂和EGFP熒光蛋白序列分別經(jīng)雙酶切至線性片段，依次插入同樣雙酶切處理的線性載體pBluescript SK(-)內(nèi)，獲得轉(zhuǎn)移載體命名為pSK-UL56-LR-EGFP；

重組病毒PRVΔgE/TK/UL56/EGFP⁺的獲得以及熒光標(biāo)簽的剔除：采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組質(zhì)粒pSK-UL56-LR-EGFP和PRVΔgE/TK基因組共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞內(nèi)，通過蝕斑篩選獲得重組病毒PRVΔgE/TK/UL56/EGFP⁺；隨后將pcGlobin2-Cre質(zhì)粒和PRVΔgE/TK/UL56/EGFP⁺基因組共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞內(nèi)，通過蝕斑篩選獲得重組病毒PRVΔgE/TK/UL56；

(2)PRVΔgE/TK/UL56/US3四基因缺失株的構(gòu)建：

轉(zhuǎn)移載體pSK-US3-LR-EGFP構(gòu)建：擴(kuò)增PRV US3基因左右側(cè)基因序列作為同源重組的US3基因左右側(cè)同源臂，擴(kuò)增EGFP熒光蛋白序列作為標(biāo)記基因，將US3基因左右側(cè)同源臂和EGFP熒光蛋白序列分別經(jīng)雙酶切至線性片段，依次插入同樣雙酶切處理的線性載體pBluescript SK(-)內(nèi)，獲得轉(zhuǎn)移載體命名為pSK-US3-LR-EGFP；

重組病毒PRVΔgE/TK/UL56/US3/EGFP⁺的獲得：采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組質(zhì)粒pSK-US3-LR-EGFP和PRVΔgE/TK/UL56基因組共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞內(nèi)，通過蝕斑篩選獲得表達(dá)綠色熒光蛋白的重組病毒PRVΔgE/TK/UL56/US3/EGFP⁺；

重組病毒PRVΔgE/TK/UL56/US3/EGFP⁺熒光標(biāo)簽的剔除：采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法和Cre-LoxP技術(shù)，將pcGlobin2-Cre質(zhì)粒和PRVΔgE/TK/UL56/US3/EGFP⁺基因組共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞內(nèi)，通過蝕斑篩選獲得不帶綠色熒光標(biāo)簽的重組病毒PRVΔgE/TK/UL56/US3。