[發(fā)明專利]一種可用于外泌體示蹤的重組胰腺癌細(xì)胞及其應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210040013.6
• 申請(qǐng)日: 2022-01-14
• 公開（公告）號(hào): CN115305253A
• 公開（公告）日: 2022-11-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 肖明兵;吳桐;陳飛;林仁杰;季潔;馬彭;崔小鵬;錢坤艷;徐偉松
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南通大學(xué)附屬醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12N15/62
• 分類號(hào): C12N15/62;C12N5/10;C12N15/85;C12Q1/02;G01N33/574;G01N33/58;G01N21/64
• 代理公司: 北京方圓嘉禾知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11385
• 代理人: 戴嵩瑋

本發(fā)明提供了一種可用于外泌體示蹤的重組胰腺癌細(xì)胞及其應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域；所述重組胰腺癌細(xì)胞包含重組載體；所述重組載體上插入有目的基因pHluorin_M153R?CD63。本發(fā)明利用插入有目的基因pHluorin_M153R?CD63的重組載體進(jìn)行胰腺癌穩(wěn)定細(xì)胞系的構(gòu)建，并對(duì)細(xì)胞外的外泌體及其釋放于細(xì)胞外基質(zhì)中的尾部斑點(diǎn)進(jìn)行有效標(biāo)記后，可更容易地觀察其尋徑軌跡，從而揭示遷移活細(xì)胞的致病行為。本發(fā)明解決了外泌體致病行為機(jī)制研究中的可視化難題，構(gòu)建得到了明亮、穩(wěn)定、且適用于多種細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的熒光示蹤物質(zhì)，可監(jiān)測(cè)活細(xì)胞在遷移過程中外泌體的釋放和攝取量，以及尋徑軌跡的觀察。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種可用于外泌體示蹤的重組胰腺癌細(xì)胞及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

外泌體是一類大小為30～150nm、呈茶托狀的由脂質(zhì)雙層膜包裹的細(xì)胞外囊泡，廣泛存在于細(xì)胞培養(yǎng)上清及各種體液中，包括血液、淋巴液、唾液、尿液、卵泡液、精液、心包液、乳汁等。外泌體起源于細(xì)胞內(nèi)體，細(xì)胞質(zhì)膜的連續(xù)內(nèi)陷最終導(dǎo)致多囊泡體的形成，多囊泡體與細(xì)胞內(nèi)的其他囊泡和細(xì)胞器相互作用，導(dǎo)致外泌體的最終形成，并促進(jìn)外泌體成分的多樣性。細(xì)胞成分通過外泌體進(jìn)行細(xì)胞間的交流與運(yùn)輸，腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體可以通過塑造腫瘤微環(huán)境來幫助其轉(zhuǎn)移，其分泌數(shù)量可直接影響到腫瘤的轉(zhuǎn)移，也在促進(jìn)腫瘤形成和增殖的過程中發(fā)揮十分重要的作用。據(jù)報(bào)道，外泌體存在于所有生物體液中，通過生物體液取樣可以很容易地獲得外泌體復(fù)合物的組成，基于生物液體活檢可顯示出外泌體在診斷腫瘤和其他疾病以及揭示其預(yù)后的方面有著重大潛力能。而外泌體具體致病行為機(jī)制的研究難以突破，多受限于其行為過程的可視化呈現(xiàn)。

胰腺癌是消化道常見惡性腫瘤之一，在腫瘤領(lǐng)域素有“癌癥之王”的稱號(hào)。胰腺癌具有外泌體明顯分泌增強(qiáng)的特點(diǎn)，研究胰腺癌疾病深層機(jī)制的一大難題就是對(duì)外泌體行為的觀察、測(cè)量及可視化。

體內(nèi)追蹤外泌體可以提供有關(guān)外泌體的生物分布、遷移能力、毒性、生物學(xué)的重要知識(shí)角色，溝通能力和行動(dòng)機(jī)制。現(xiàn)有技術(shù)中，研究人員使用分子生物學(xué)方法將熒光蛋白(例如綠色熒光蛋白GFP；紅色熒光蛋白R(shí)FP)與外泌體膜上的標(biāo)記蛋白如CD63、CD9、CD81等融合表達(dá)可以跟蹤外泌體從供體到受體細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)。通過監(jiān)測(cè)膜蛋白的熒光，可以實(shí)現(xiàn)活體培養(yǎng)物中和體內(nèi)外泌體轉(zhuǎn)移的直接可視化。例如，將外泌體的特定蛋白CD63和綠色熒光蛋白GFP的表達(dá)元件構(gòu)建成質(zhì)粒再包裝到慢病毒中，隨后用此慢病毒感染細(xì)胞，使細(xì)胞分泌的外泌體帶有綠色熒光。但是，常規(guī)的GFP-CD63的外泌體示蹤方法中，熒光不穩(wěn)定且不夠明亮，難以對(duì)動(dòng)態(tài)的外泌體釋放及攝取實(shí)行可視化。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種可用于外泌體示蹤的重組胰腺癌細(xì)胞及其應(yīng)用，基于本發(fā)明重組胰腺癌細(xì)胞進(jìn)行的外泌體示蹤方法，熒光穩(wěn)定且明亮，能夠?qū)?dòng)態(tài)的外泌體釋放及攝取實(shí)行可視化。

本發(fā)明提供了一種可用于外泌體示蹤的重組胰腺癌細(xì)胞，所述重組胰腺癌細(xì)胞包含重組載體；所述重組載體上插入有目的基因pHluorin_M153R-CD63；所述目的基因pHluorin_M153R-CD63為氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白的編碼基因。

優(yōu)選的，所述重組載體的原始載體包括pCDH-CMV-MCS-EF1-PURO。

優(yōu)選的，所述pHluorin_M153R-CD63在pCDH-CMV-MCS-EF1-PURO上的插入位點(diǎn)的5’端的限制性酶切位點(diǎn)為EcoR I，3’端的限制性酶切位點(diǎn)為NotI。

本發(fā)明還提供了上述方案所述的重組胰腺癌細(xì)胞在制備用于胰腺癌細(xì)胞外泌體示蹤的試劑或試劑盒中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了一種胰腺癌細(xì)胞外泌體示蹤的方法，包括以下步驟：

使用熒光顯微鏡對(duì)上述方案所述的重組胰腺癌細(xì)胞進(jìn)行鏡下觀察。

優(yōu)選的，所述鏡下觀察包括活細(xì)胞觀察和/或細(xì)胞免疫熒光觀察。