[發(fā)明專利]一種腈水解酶、其構(gòu)建的工程菌及其在煙酸綠色合成中的應(yīng)用

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202210037906.5
• 申請日: 2022-01-13
• 公開（公告）號: CN114317506A
• 公開（公告）日: 2022-04-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 潘炎烽;張海峰;戴柳玲;姚靈峰;周中平
• 申請（專利權(quán)）人: 兄弟科技股份有限公司
• 主分類號: C12N9/78
• 分類號: C12N9/78;C12N15/55;C12N15/70;C12N15/66;C12N1/21;C12P17/12;C12R1/19
• 代理公司: 浙江永航聯(lián)科專利代理有限公司 33304
• 代理人: 侯蘭玉

本發(fā)明屬于生物技術(shù)工業(yè)應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及一種腈水解酶、其構(gòu)建的工程菌及其在煙酸綠色合成中的應(yīng)用。本發(fā)明構(gòu)建含腈水解酶突變體基因的大腸桿菌重組工程菌，命名為大腸桿菌E.coli PST2?NL，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后獲得的濕菌體為酶源，以3?氰基吡啶為底物，反應(yīng)獲得30%?50%的煙酸銨反應(yīng)液，轉(zhuǎn)化率和選擇性都達(dá)到100%。本發(fā)明將煙酸銨反應(yīng)液經(jīng)濃縮降溫結(jié)晶形成煙酸銨晶體，晶體部分進(jìn)入干燥器中干燥脫氨，干燥溫度控制為80?150℃，干燥時間2?5h，得到煙酸產(chǎn)物，產(chǎn)物得率99.8%以上。將母液回收套用至濃縮工段，吸收分解產(chǎn)生的氨，制成液氨用于3?甲基吡啶氨氧化反應(yīng)，提高全產(chǎn)業(yè)鏈的原子經(jīng)濟性，實現(xiàn)綠色合成。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)工業(yè)應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及一種腈水解酶、其構(gòu)建的工程菌及其在煙酸綠色合成中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

煙酸屬于維生素B族，又稱尼克酸、維生素B₃、抗癩皮病因子，化學(xué)名稱吡啶-3-甲酸，熱穩(wěn)定性好，能升華，是人體必需的13種維生素之一。目前，煙酸主要用于飼料添加劑，可提高飼料蛋白的利用率，提高奶牛產(chǎn)奶量及魚、雞、鴨、牛、羊等禽畜肉產(chǎn)量和質(zhì)量。醫(yī)藥領(lǐng)域，煙酸可直接作為防治糙皮病等皮膚病和類似的維生素缺乏癥的有效藥物，還可用于治療動脈粥樣硬化和末梢神經(jīng)血管痙攣等病癥；煙酸可作為醫(yī)藥中間體合成酞胺和酰類藥物。此外，煙酸還在發(fā)光材料、染料、電鍍行業(yè)等領(lǐng)域發(fā)揮著不可替代的作用。

目前，煙酸工業(yè)生產(chǎn)方法主要有液相氧化法、氨氧化法、氣相氧化法、電化學(xué)氧化法等。前三種方法需要在高溫下進(jìn)行，能耗高，成本高、對環(huán)境污染嚴(yán)重等缺點。電化學(xué)氧化法制備煙酸反應(yīng)條件溫和，工藝簡單，副產(chǎn)物少，污染小，是一種比較理想的煙酸生產(chǎn)工藝，但該方法目前還停留在實驗研發(fā)階段，產(chǎn)率還需要進(jìn)一步提高。因此，尋求一種綠色高效經(jīng)濟的煙酸生產(chǎn)方式是目前面臨的重要問題之一。

生物催化法反應(yīng)條件溫和、催化劑特異性高、選擇性強、能耗少、催化劑制作成本低廉、工藝環(huán)境友好，產(chǎn)生顯著的經(jīng)濟效益。因此，生物催化是綠色化學(xué)與綠色化工發(fā)展的重要趨勢之一。但是野生菌普遍存在酶活表達(dá)量低，穩(wěn)定性較差，對底物和產(chǎn)物的耐受性不高等缺點。隨著基因工程技術(shù)的迅猛發(fā)展，通過分子改造構(gòu)建基因工程菌，提高腈水解酶的活性、穩(wěn)定性及底物耐受性等催化性能。

江南大學(xué)枯草芽孢桿菌NIT-2游離細(xì)胞能夠在13min內(nèi)完全轉(zhuǎn)化100mM底物，3-氰基吡啶的轉(zhuǎn)化率可達(dá)到100％，HPLC未檢測出副產(chǎn)物煙酰胺生成，單位菌體對底物3-氰基吡啶的平均轉(zhuǎn)化速率為16.72g/h。采用固定化小球形式底物3-氰基吡啶投料終濃度從游離細(xì)胞的150mM提升至250-550mM，折算26-57.2g/L。

R.rhodochrousJ1的靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化3-氰基吡啶生成煙酸，其轉(zhuǎn)化率能達(dá)到100％，采用分批補料的方式添加底物連續(xù)轉(zhuǎn)化26h后，煙酸的產(chǎn)量達(dá)到172g·L^-1，折算6.6g(煙酸)·h^-1·g(細(xì)胞)^-1。

固定化B.pallidus Dac521細(xì)胞轉(zhuǎn)化3-氰基吡啶獲得煙酸，采用柱式反應(yīng)器，連續(xù)注入100mmol·L^-1底物，分別在50℃和60℃獲得轉(zhuǎn)化效率為0.104g(底物)·h^-1·g(細(xì)胞)^-1和0.208g(底物)·h^-1·g(細(xì)胞)^-1。

Sharma等在1L體系的分批補料轉(zhuǎn)化中，利用4.2g小球諾卡氏菌(N.globerula)NHB-2的靜息細(xì)胞用于轉(zhuǎn)化共1M的3-氰基吡啶，98.6％的3-氰基吡啶被轉(zhuǎn)化為煙酸，其產(chǎn)率為3.21g(煙酸)·h^-1·g(細(xì)胞)^-1。

腈水解酶反應(yīng)專一性的調(diào)控對腈水解酶的工業(yè)化應(yīng)用有著重要的意義。提高腈水解酶的水解活性，專一性生成羧酸有利于產(chǎn)率的提高以及后期產(chǎn)物的分離純化，為腈水解酶工業(yè)化生產(chǎn)提供便利。