[發明專利]一種腈水解酶、其構建的工程菌及其在煙酸綠色合成中的應用

在審

• 申請號: 202210037906.5
• 申請日: 2022-01-13
• 公開（公告）號: CN114317506A
• 公開（公告）日: 2022-04-12
• 發明（設計）人: 潘炎烽;張海峰;戴柳玲;姚靈峰;周中平
• 申請（專利權）人: 兄弟科技股份有限公司
• 主分類號: C12N9/78
• 分類號: C12N9/78;C12N15/55;C12N15/70;C12N15/66;C12N1/21;C12P17/12;C12R1/19
• 代理公司: 浙江永航聯科專利代理有限公司 33304
• 代理人: 侯蘭玉

1.一種腈水解酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一種編碼如權利要求1所述的腈水解酶的編碼基因，其特征在于，所述編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.一種由權利要求1所述的腈水解酶基因構建的大腸桿菌重組工程菌，命名為大腸桿菌E.coli PST2-NL。

4.一種權利要求3所述大腸桿菌E.coli PST2-NL的構建方法，其特征在于構建步驟如下：

1)腈水解酶基因PST2-NL的基因合成：以極小單胞菌屬(Pusillimonas sp.T2)中腈水解酶基因的DNA序列信息，全基因合成腈水解酶基因PST2-NL；

2)利用限制性內切酶對pET21a(+)進行雙酶切，經瓊脂糖凝膠電泳分析回收獲得經酶切的pET21a(+)質粒；將經同樣酶切后的腈水解酶基因與pET21a(+)質粒連接，得到重組質粒pET21a(+)-PST2-NL；

3)將重組質粒pET21a(+)-PST2-NL經熱激轉化導入E.coli BL21(DE3)感受態細胞中，構建獲得可高產重組腈水解酶的大腸桿菌E.coli PST2-NL。

5.一種大腸桿菌E.coli PST2-NL的高密度發酵方法，其特征在于該方法步驟如下：

1)將E.coli PST2-NL接種到含終濃度為0.1g/L氨芐青霉素的200ml LB液體培養基中，37℃，160rpm/min震蕩培養8-10小時，OD₆₀₀＝4.0-6.0時移種，培養液以3-10％體積比接種到含有0.1g/L氨芐青霉素的發酵培養基中進行發酵培養；

2)通過調節攪拌轉速、通氣量的方式，控制發酵全程DO在30％±2％；

3)通過補加氨水的方式來控制pH在7.0±0.2；

4)當DO出現明顯回升時，開始流加補料，培養至OD₆₀₀＝30-50時加入終濃度為0.2mmol/L的IPTG誘導培養8-12h，菌體濃度達到100-140g/L，放料OD₆₀₀達到100-140，發酵液離心后得到濕菌體。

6.根據權利要求5所述的高密度發酵方法，其特征在于發酵和補料培養采用的培養基為：

1)所述發酵培養基(g/L)：甘油20-50，酵母粉10-20，磷酸二氫鉀5-10，磷酸氫二鉀10-15，硫酸銨5-10，一水檸檬酸1-3，以及微量元素5-20mL/L；

2)所述補料培養基組分為(g/L)：甘油500-800，硫酸銨10-20，硫酸鎂5-10，以及微量元素2-5mL/L；

3)微量元素溶液g/L：FeCl₃·6H₂O：1.6，CoCl₂·6H₂O：0.37，CuCl₂·2H₂O：0.13，ZnCl₂·4H₂O：0.2，NaMoO₄·2H₂O：0.2，H₃BO₃：0.05，EDTA·2Na：0.2，以及HCl：10mL。

7.一種權利要求3所述的大腸桿菌E.coli PST2-NL在煙酸銨生產中的應用，其特征在于：

以重組工程菌經誘導表達后獲得的濕菌體為酶源，以3-氰基吡啶為反應底物，底物濃度控制濃度在250-420g/L，體系pH控制在7.90-8.00，在30-40℃條件下反應制備煙酸銨。