[發(fā)明專利]一種含有雙sgRNA的特異性基因敲除的CRISPR/Cas9編輯質(zhì)粒及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210037651.2
• 申請日: 2022-01-13
• 公開（公告）號: CN114317580A
• 公開（公告）日: 2022-04-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 錢秀萍;胡夢怡;戈梅;魏維;饒敏;張蕓;王孟圓
• 申請（專利權(quán)）人: 上海交通大學;上海來益生物藥物研究開發(fā)中心有限責任公司
• 主分類號: C12N15/74
• 分類號: C12N15/74;C12N15/66;C12N15/113;C12N1/21;C12R1/01
• 代理公司: 上海華工專利事務(wù)所(普通合伙) 31104
• 代理人: 趙孟琴;繆利明

本發(fā)明公開了一種含有雙sgRNA的特異性基因敲除的CRISPR/Cas9編輯質(zhì)粒，包括雙sgRNA和上下游同源臂，所述雙sgRNA的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；所述的上下游同源臂是以A.keratiniphila HCCB10007基因組為模板，分別用SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示的引物進行PCR擴增獲得。本發(fā)明還公開了所述的CRISPR/Cas9編輯質(zhì)粒在水解角蛋白擬無枝酸菌中進行大片段基因敲除的應(yīng)用。本發(fā)明實現(xiàn)了在水解角蛋白擬無枝酸菌中進行80kb以上大片段基因的精準敲除。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，是關(guān)于一種含有雙sgRNA的特異性基因敲除的CRISPR/Cas9編輯質(zhì)粒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

微生物次級代謝產(chǎn)物是臨床上廣泛應(yīng)用的各類抗生素、抗病毒藥物、抗真菌藥物、免疫抑制劑等藥物的重要來源。由于微生物基因組的復雜性，除了生長繁殖相關(guān)的必須基因外，基因組中還存在著眾多次級代謝生物合成基因簇。但有很多次級代謝生物合成基因簇處于沉默狀態(tài)，甚至屬于冗余基因，其存在會與目標產(chǎn)物的生物合成產(chǎn)生競爭，它的表達會消耗大量初級代謝產(chǎn)生的能量和前體，并且還會導致雜質(zhì)的產(chǎn)生，降低目標產(chǎn)物的產(chǎn)量并且為分離與純化增加難度。因此對微生物細胞進行工程設(shè)計，去除冗余的大片段基因，以高效合成高附加值的天然產(chǎn)物已受到越來越多的關(guān)注。

傳統(tǒng)基因組簡化的方法包括同源重組、雙鏈斷裂修復重組、位點特異性重組、轉(zhuǎn)座重組，但它們都或多或少存在基因編輯工具構(gòu)建復雜、在基因組上殘留片段無法實現(xiàn)無痕敲除、基因刪減存在不確定性等問題。CRISPR/Cas9系統(tǒng)，是目前應(yīng)用較為廣泛的高效、簡便、能對基因組進行定點編輯的新技術(shù)，該系統(tǒng)只需Cas9蛋白、crRNA和tracrRNA連接而成的sgRNA參與。CRISPR/Cas9系統(tǒng)能夠?qū)蜻M行高效編輯，利用同源重組修復的方式能實現(xiàn)基因無痕敲除。

萬古霉素是目前臨床上治療耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)感染的首選藥物，還應(yīng)用于治療對所有抗生素均無效的嚴重感染，在臨床治療中具有重要意義。A.keratiniphila HCCB10007是經(jīng)過物理、化學方法誘變選育而來的萬古霉素高產(chǎn)菌株，基因組包含一個環(huán)狀染色體、一個環(huán)形內(nèi)源性質(zhì)粒。染色體基因組全長8,948,591bp，GC含量69％，通過對其進行生物信息分析，預測到在基因組中存在至少26個次級代謝生物合成基因簇。雖然CRISPR/Cas9系統(tǒng)已成功地應(yīng)用于大腸桿菌、釀酒酵母菌、肺炎鏈球菌、鏈霉菌等微生物，在鏈霉菌中進行大片段基因編輯也有較高效率，A.keratiniphila HCCB10007雖然同屬于放線菌，但與鏈霉菌相比，其基因組結(jié)構(gòu)更加復雜，次級代謝產(chǎn)物網(wǎng)絡(luò)更加龐大，在該菌株上應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)進行大片段基因敲除仍然具有極大挑戰(zhàn)性。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的第一個目的是提供一種含有雙sgRNA的特異性基因敲除的CRISPR/Cas9編輯質(zhì)粒。本發(fā)明的第二個目的在于提供一種含有雙sgRNA的特異性基因敲除的CRISPR/Cas9編輯質(zhì)粒的構(gòu)建方法。本發(fā)明的第三個目的是提供一種含有雙sgRNA的特異性基因敲除的CRISPR/Cas9編輯質(zhì)粒在水解角蛋白擬無枝酸菌中進行大片段基因敲除的應(yīng)用。本發(fā)明的第四個方面是提供一種用于敲除A.keratiniphila HCCB10007大的片段基因的雙sgRNA。本發(fā)明的第五個方面是提供一種敲除A.keratiniphila HCCB10007上的大片段基因后用于同源重組修復的上下游同源臂。本發(fā)明的第六個方面是提供一種敲除大片段基因的A.keratiniphila HCCB10007突變菌株。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：