[發明專利]一種含有雙sgRNA的特異性基因敲除的CRISPR/Cas9編輯質粒及其應用

在審

• 申請號: 202210037651.2
• 申請日: 2022-01-13
• 公開（公告）號: CN114317580A
• 公開（公告）日: 2022-04-12
• 發明（設計）人: 錢秀萍;胡夢怡;戈梅;魏維;饒敏;張蕓;王孟圓
• 申請（專利權）人: 上海交通大學;上海來益生物藥物研究開發中心有限責任公司
• 主分類號: C12N15/74
• 分類號: C12N15/74;C12N15/66;C12N15/113;C12N1/21;C12R1/01
• 代理公司: 上海華工專利事務所(普通合伙) 31104
• 代理人: 趙孟琴;繆利明

1.一種含有雙sgRNA的特異性基因敲除的CRISPR/Cas9編輯質粒，其特征在于，包括用于敲除A.keratiniphila HCCB10007大的片段基因的雙sgRNA和敲除A.keratiniphilaHCCB10007上的大片段基因后用于同源重組修復的上下游同源臂，所述雙sgRNA的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；所述用于同源重組修復的上下游同源臂是以A.keratiniphila HCCB10007基因組為模板，分別用SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8和SEQ IDNO.9、SEQ ID NO.10所示的引物進行PCR擴增獲得。

2.如權利要求1所述的CRISPR/Cas9編輯質粒，其特征在于，所述的CRISPR/Cas9編輯質粒是通過如下步驟構建獲得：

步驟一、使用Hind III酶切pLYNY04質粒，獲得酶切后的載體；將酶切后的線性化載體與所述的上下游同源臂采用overlap重組的方式進行連接以獲得骨架質粒；

步驟二、使用SpeⅠ酶切骨架質粒，獲得線性化骨架載體；將如SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4所示的兩條oligo退火連接形成雙鏈sgRNA-1，將如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的兩條oligo退火連接形成雙鏈sgRNA-2，然后將線性化骨架載體分別與雙鏈sgRNA-1和雙鏈sgRNA-2采用overlap重組的方式進行連接，獲得含有單一sgRNA-1的編輯質粒和含有單一sgRNA-2的編輯質粒；

步驟三、使用XbaI酶切含有單一sgRNA-1的編輯質粒，獲得線性化sgRNA-1載體；以含有單一sgRNA-2的編輯質粒為模板，用如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示的引物利用PCR的方法擴增含有ermE^*啟動子和sgRNA-2的基因片段；然后將ermE^*啟動子和sgRNA-2的基因片段與含有單一sgRNA-1的編輯質粒的線性化sgRNA-1載體進行連接，獲得含有雙sgRNA的編輯質粒pHMYECO4-26。

3.一種含有雙sgRNA的特異性基因敲除的CRISPR/Cas9編輯質粒的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟一、以A.keratiniphila HCCB10007基因組為模板，分別用SEQ ID NO.7、SEQ IDNO.8和SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示的引物進行PCR擴增，獲得用于同源重組修復的上下游同源臂；

步驟二、使用Hind III酶切pLYNY04質粒，獲得酶切后的載體；然后將酶切后的線性化載體與擴增得到的上下游同源臂采用overlap重組的方式進行連接以獲得骨架質粒；

步驟三、使用SpeⅠ酶切骨架質粒，獲得線性化骨架載體；將如SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4所示的兩條oligo退火連接形成雙鏈sgRNA-1，將如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的兩條oligo退火連接形成雙鏈sgRNA-2，然后將線性化骨架載體分別與雙鏈sgRNA-1和雙鏈sgRNA-2采用overlap重組的方式進行連接，獲得含有單一sgRNA-1的編輯質粒和含有單一sgRNA-2的編輯質粒；

步驟四、使用XbaI酶切含有單一sgRNA-1的編輯質粒，獲得線性化sgRNA-1載體；以含有單一sgRNA-2的編輯質粒為模板，用如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示的引物利用PCR的方法擴增含有ermE^*啟動子和sgRNA-2的基因片段；然后將ermE^*啟動子和sgRNA-2的基因片段與含有單一sgRNA-1的編輯質粒的線性化sgRNA-1載體進行連接，采用overlap重組的方式，獲得含有雙sgRNA的編輯質粒pHMYECO4-26。

4.一種如權利要求1或2所述的含有雙sgRNA的特異性基因敲除的CRISPR/Cas9編輯質粒在水解角蛋白擬無枝酸菌中進行大片段基因敲除的應用。

5.如權利要求4所述的應用，其特征在于，所述水解角蛋白擬無枝酸菌包括A.keratiniphila HCCB10007。