[發(fā)明專利]一種基于多交叉置換擴增檢測腦膜炎奈瑟菌的引物和方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210034587.2
• 申請日: 2022-01-12
• 公開（公告）號: CN114480681A
• 公開（公告）日: 2022-05-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 胡守奎;閆琳琳;趙帆;唐沖;蔡煜;農(nóng)金輕;張可;朱琳琳;王鵬飛;吳蕾;朱曉雪
• 申請（專利權(quán)）人: 首鋼醫(yī)院有限公司
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/6804;C12N15/11;C12R1/36
• 代理公司: 北京華沛德權(quán)律師事務(wù)所 11302
• 代理人: 馬苗苗

本發(fā)明屬于腦膜炎奈瑟菌檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種基于多交叉置換擴增檢測腦膜炎奈瑟菌的引物和方法。所述引物包括第一引物，所述第一引物包括：交叉內(nèi)引物對、置換引物對和三組擴增引物對；其核苷酸序列如SEQ ID NO：1?SEQ ID NO：10所示，將本申請引物進行MCDA擴增，對原始核酸序列起到指數(shù)級別的放大作用，提高檢測精度，縮短檢測時間。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于腦膜炎奈瑟菌檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種基于多交叉置換擴增檢測腦膜炎奈瑟菌的引物和方法。

背景技術(shù)

腦膜炎奈瑟菌，是流行性腦脊髓膜炎(簡稱流腦)的病原菌。腎形或豆形革蘭陰性雙球菌，兩菌接觸面平坦或略向內(nèi)陷，直徑0.6～0.8μm。人工培養(yǎng)后可成卵圓形或球狀，排列較不規(guī)則，單個、成雙或4個相連等。在孵育24h后的培養(yǎng)物中，常呈現(xiàn)衰退形態(tài)，菌體大小較不一致，著色亦深淺不勻。在患者腦脊液中，多位于中性粒細胞內(nèi)，形態(tài)典型。

流行性腦脊髓膜炎，是一種由腦膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)感染引起的以腦膜炎和敗血癥為主要臨床表現(xiàn)的急性呼吸道傳染病。即使患者在發(fā)病24-48小時內(nèi)獲得治療，流腦的病死率仍然高達5％-10％，并且約10％-20％的幸存者會遺留精神異常及截肢等明顯的后遺癥。根據(jù)細菌的莢膜多糖結(jié)構(gòu)，腦膜炎奈瑟菌可分為12個血清群，A、B、C、W135、X、Y群是目前發(fā)現(xiàn)引起全球流腦流行的六種主要致病血清群。據(jù)我國近幾年的流腦監(jiān)測資料顯示，我國目前腦膜炎奈瑟菌的流行以A、B、C、W135群為主要優(yōu)勢菌群，偶爾出現(xiàn)X群和Y群腦膜炎奈瑟菌感染病例的報道。該菌以人類為其唯一的已知宿主，寄生在鼻咽部，通過呼吸道飛沫傳播或者通過口腔分泌物接觸傳播。薈萃分析顯示我國腦膜炎奈瑟菌的總體帶菌率為2.7％。雖然僅部分攜帶者會出現(xiàn)臨床癥狀，但無癥狀的帶菌者被認為是流腦的主要傳染源。因此，做好腦膜炎奈瑟菌及其血清群檢測和鑒定的技術(shù)儲備工作十分必要。

流腦發(fā)病急、進程快及病死率高與該病難以早期診斷有關(guān)。因此對于已經(jīng)感染腦膜炎奈瑟菌或流腦發(fā)病的患者，盡快診斷并開始抗生素治療是關(guān)鍵。

目前，臨床上對腦膜炎奈瑟菌的血清學分群是在流腦確診基礎(chǔ)上，通過血清玻片凝集法對腦膜炎奈瑟菌進行血清群鑒定。此方法不僅需要培養(yǎng)出純菌，費時費力，還因易受其他非特異因素的影響，導致檢出率低，漏檢率高，常延誤診斷，耽誤對患者病情的治療及對流腦流行的有效控制。因此，建立快速、精準鑒定腦膜炎奈瑟菌及其血清群的分子檢測方法，是及時有效診斷、控制與預(yù)防流腦傳播的重要手段，對于流腦防治非常必要。

隨著核酸診斷技術(shù)的快速發(fā)展，國內(nèi)外已有部分實驗室將以PCR為基礎(chǔ)的檢測技術(shù)，如普通PCR、熒光PCR等，用于快速鑒定腦膜炎奈瑟菌及其血清群。這些PCR方法與傳統(tǒng)方法相比具有敏感性強、特異性高、快速等優(yōu)點，但因依賴于特殊而昂貴的儀器設(shè)備、熟練地操作人員及后續(xù)的電泳操作，對于基層單位或條件落后的實驗室難以推廣，在一定程度上限制了這些技術(shù)的廣泛應(yīng)用。因此還需探討更加便捷的方法，應(yīng)對流腦暴發(fā)或流行。

近年發(fā)展起來的多種恒溫擴增技術(shù)，較PCR技術(shù)而言，不依賴于熱循環(huán)擴增設(shè)備，反應(yīng)速度快，敏感性好。因此，有利于實現(xiàn)快速擴增，便捷檢測及現(xiàn)場診斷。到目前為止，應(yīng)用較為廣泛的恒溫擴增技術(shù)有滾環(huán)擴增(RCA)、鏈置換擴增(SDA)、解旋酶依賴的恒溫擴增(HDA)、環(huán)介導恒溫擴增(LAMP)、交叉擴增(CPA)及多交叉置換擴增(MCDA)等。

發(fā)明內(nèi)容

本申請?zhí)峁┝艘环N基于多交叉置換擴增檢測腦膜炎奈瑟菌的引物和方法，以解決現(xiàn)有檢測腦膜炎奈瑟菌精度低的技術(shù)問題。

第一方面，本申請?zhí)峁┝艘环N基于多交叉置換擴增檢測腦膜炎奈瑟菌的引物，所述引物包括第一引物，所述第一引物包括：如核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的置換引物F1和如核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的置換引物F2；

如核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的交叉內(nèi)引物CP1和如核苷酸序列如SEQ IDNO：4所示的交叉內(nèi)引物CP2；