[發明專利]一種基于多交叉置換擴增檢測腦膜炎奈瑟菌的引物和方法

在審

• 申請號: 202210034587.2
• 申請日: 2022-01-12
• 公開（公告）號: CN114480681A
• 公開（公告）日: 2022-05-13
• 發明（設計）人: 胡守奎;閆琳琳;趙帆;唐沖;蔡煜;農金輕;張可;朱琳琳;王鵬飛;吳蕾;朱曉雪
• 申請（專利權）人: 首鋼醫院有限公司
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/6804;C12N15/11;C12R1/36
• 代理公司: 北京華沛德權律師事務所 11302
• 代理人: 馬苗苗

1.一種基于多交叉置換擴增檢測腦膜炎奈瑟菌的引物，其特征在于，所述引物包括第一引物，所述第一引物包括：

如核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的置換引物F1和如核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的置換引物F2；

如核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的交叉內引物CP1和如核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的交叉內引物CP2；

如核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示的擴增引物C1和如核苷酸序列如SEQ ID N0：6所示的擴增引物C2；

如核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示的擴增引物D1和如核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示的擴增引物D2；

如核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示的擴增引物R1和如核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示的擴增引物R2。

2.根據權利要求1所述的引物，其特征在于，所述引物還包括第二引物，用于腦膜炎奈瑟菌血清群檢測，所述第二引物包括：第一組引物、第二組引物、第三組引物和第四組引物中的至少一組，所述第一組引物為特異基因sacB的引物，所述第二組引物為針對特異基因siaD第一區域的引物，所述第三組引物為針對特異基因siaD第二區域的引物，所述第四組引物為特異基因synG的引物。

3.根據權利要求2所述的引物，其特征在于，所述第一組引物包括：核苷酸序列如SEQID NO：11-12所示的置換引物對A，核苷酸序列如SEQ ID NO：13-14所示的交叉內引物對A，核苷酸序列如SEQ ID NO：15-20所示的三組擴增引物對A。

4.根據權利要求2所述的引物，其特征在于，所述第二組引物包括：核苷酸序列如SEQID NO：21-22所示的置換引物對B，核苷酸序列如SEQ ID NO：23-24所示的交叉內引物對B，核苷酸序列如SEQ ID NO：25-30所示的三組擴增引物對B。

5.根據權利要求2所述的引物，其特征在于，所述第三組引物包括：核苷酸序列如SEQID NO：31-32所示的置換引物對C，核苷酸序列如SEQ ID NO：33-34所示的交叉內引物對C，核苷酸序列如SEQ ID NO：35-40所示的三組擴增引物對C。

6.根據權利要求2所述的引物，其特征在于，所述第四組引物包括：核苷酸序列如SEQID NO：41-42所示的置換引物對W135，核苷酸序列如SEQ ID NO：43-44所示的交叉內引物對W135，核苷酸序列如SEQ ID NO：45-50所示的三組擴增引物對W135。

7.一種基于多交叉置換擴增檢測腦膜炎奈瑟菌的引物的使用方法，其特征在于，所述方法包括：將權利要求1所述的引物進行MCDA擴增，所述MCDA擴增的反應溫度為62-67℃。

8.一種基于多交叉置換擴增檢測腦膜炎奈瑟菌的引物的使用方法，其特征在于，將權利要求1所述的第一引物進行MCDA擴增，所述MCDA擴增的目標基因片段模板濃度≥10fg。

9.一種基于多交叉置換擴增檢測腦膜炎奈瑟菌的檢測器具，其特征在于，所述檢測器具的組成部件包括：樣品墊、金標墊、纖維膜、吸水墊及背板，所述樣品墊、金標墊、纖維膜及吸水墊依次組裝在背板上；

所述金標墊中物質包括：金納米粒子偶聯的鏈霉素親和素；

所述纖維膜中物質包括：含抗異硫氰酸熒光素的捕獲抗體和生物素偶聯的牛血清蛋白；

所述檢測器具還包括：如權利要求1-6任意一項所述的引物，用于對待檢測物進行MCDA擴增以使擴增產物滴入所述樣品墊。

10.基于多交叉置換擴增的腦膜炎奈瑟菌及其血清群的檢測方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

得到如權利要求1-6任意一項的所述引物；

在所述引物的擴增引物中，任意一條擴增引物的5’端標記異硫氰酸熒光素，任意一條擴增引物的5’端標記生物素，得到標識有異硫氰酸熒光素和生物素的第三引物；

將待檢測物與所述第三引物進行MCDA擴增，得到雙標MCDA產物；

對所述雙標MCDA產物進行金納米檢測，判斷所述待檢測物是否有腦膜炎奈瑟菌及其血清群。