[發明專利]非整合慢病毒載體系統在基因編輯器遞送中的應用

在審

• 申請號: 202210031163.0
• 申請日: 2022-01-12
• 公開（公告）號: CN114395586A
• 公開（公告）日: 2022-04-26
• 發明（設計）人: 張學禮;畢昌昊;王玉杰
• 申請（專利權）人: 中國科學院天津工業生物技術研究所
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N15/54;C12N15/38;C12N15/113;C12N15/62;C12N5/10
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

本發明公開了非整合慢病毒載體系統在制備堿基編輯器遞送產品中的應用，所述非整合慢病毒載體系統轉染宿主細胞后能獲得非整合的慢病毒，所述非整合慢病毒載體系統包括表達堿基編輯器的重組慢病毒載體、表達整合酶的質粒和表達VSV囊膜G蛋白的質粒。本發明提供的利用慢病毒載體遞送堿基編輯器的方法，可以將堿基編輯器完整的插入同一載體中，并且將整合酶進行突變，使其不能整合至宿主染色體中，能夠高效且相對安全的遞送堿基編輯器至靶細胞中，實現特定位點的基因編輯。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及非整合慢病毒載體系統在基因編輯器遞送中的應用。

背景技術

遺傳疾病是臨床治療的難題，目前絕大部分遺傳疾病都沒有有效的治療手段。基因編輯是消除這類疾病的有效方法之一，利用基因編輯技術只需一次治療就可長期改變病人的DNA，達到永久治愈的效果。迄今為止，已知的人類致病性突變中，約一半是點突變(也稱為單核苷酸多態性,single nucleotide polymorphism,SNP)。高效、準確地糾正致病性SNP對于研究和治療遺傳性疾病具有重要意義。

堿基編輯(base editing,BE)無需產生DNA雙鏈斷裂，也無需供體DNA的參與，可實現靶位點的精準點突變，在單核苷酸遺傳疾病治療上具有重大應用前景。現有的堿基編輯器主要有胞嘧啶堿基編輯器(Cytosine base editor，CBE)，可將一定窗口內的胞嘧啶核苷酸轉化為胸腺嘧啶核苷酸(CT)；腺嘌呤堿基編輯器(Adenine base editor，ABE)，可將一定窗口內的腺嘌呤核苷酸轉化為鳥嘌呤核苷酸(AG)以及新型糖基化酶堿基編輯器(Glycosylase base editor,GBE)，在大腸桿菌中可將胞嘧啶核苷酸編輯成腺嘌呤核苷酸、在哺乳動物細胞中可將胞嘧啶核苷酸特異性編輯成鳥嘌呤核苷酸。

如何將堿基編輯器高效遞送至靶細胞是當前基因治療領域面臨的一大難題。主要的遞送載體包括病毒類載體和非病毒類載體，其中病毒類載體包括慢病毒、AAV病毒(腺相關病毒)和腺病毒。其中AAV病毒是目前應用比較廣的一種載體，但是其一個缺點是其包裝容量有限，僅能包裝4.7kb以內的片段，而堿基編輯器一般在5kb以上，因此在同一載體中不能容納整個堿基編輯器，需要將堿基編輯器進行拆分成兩段才能通過AAV進行遞送。慢病毒載體的包裝容量較大，可以將堿基編輯器完整的插入同一載體中，但是經典的慢病毒載體會將其基因組整合至宿主染色體中，從而存在一定的插入突變的風險。

發明內容

本發明要解決的技術問題是如何用慢病毒載體系統實現堿基編輯器非整合遞送。

為解決上述技術問題，第一個方面，本發明提供非整合慢病毒載體系統在制備堿基編輯器遞送產品中的應用，所述非整合慢病毒載體系統轉染宿主細胞后能獲得非整合的慢病毒，所述非整合慢病毒載體系統包括表達堿基編輯器的重組慢病毒載體、表達整合酶的質粒和表達VSV囊膜G蛋白的質粒。

本發明中，所述非整合慢病毒載體系統可為載體組合物。

本發明中，所述產品可為試劑或試劑盒。

進一步地，上述的應用中，所述整合酶是將HIV整合酶的第64位氨基酸由D(天冬氨酸)突變為V(纈氨酸)，保持HIV整合酶的其它氨基酸不變得到的蛋白質。

本發明中，所述整合酶是氨基酸序列是SEQ ID No.6所示的蛋白質。

上述突變獲得的突變整合酶喪失了整合活性，沒有將慢病毒載體上的基因整合到宿主基因組中的能力。

進一步地，上述的應用中，所述堿基編輯器為CBE堿基編輯器、ABE堿基編輯器或PE堿基編輯器中的一種或幾種；