[發明專利]瓦倫烯合酶突變體及瓦倫烯高產菌株

在審

• 申請號: 202210027320.0
• 申請日: 2022-01-11
• 公開（公告）號: CN116463325A
• 公開（公告）日: 2023-07-21
• 發明（設計）人: 葉紫玲
• 申請（專利權）人: 武漢合生科技有限公司
• 主分類號: C12N9/88
• 分類號: C12N9/88;C12N15/60;C12N15/81;C12N1/19;C12P5/00;C12R1/865
• 代理公司: 北京清亦華知識產權代理事務所(普通合伙) 11201
• 代理人: 張培培

本發明公開了瓦倫烯合酶突變體及瓦倫烯高產菌株，屬于合成生物學領域。合成瓦倫烯的酶來源于刺芹Eryngium?glaciale，經過酶的定向進化獲得了酶性能提升的瓦倫烯合酶突變體，含有該突變體的菌株產量是含有野生型合成酶的菌株產量的3.15倍。本發明的瓦倫烯合酶突變體加強了菌株合成瓦倫烯的能力，為其工業化生產奠定了強有力的基礎。本發明利用瓦倫烯合成酶突變體構建了合成瓦倫烯的高產菌株，發酵罐產量達到了12.4g/L，是目前所報道的最高水平。

技術領域

本發明屬于合成生物學領域，涉及瓦倫烯合酶突變體及瓦倫烯高產菌株。

背景技術

瓦倫烯是一種具有柑橘香味的倍半萜化合物，是商業規模使用的最有價值的萜類化合物之一，作為調味劑被廣泛用于食品、飲料領域，具有很高的經濟價值。目前瓦倫烯主要是通過植物提取獲得，但由于植物中含量低、提取成本高，使得這種方法并不是經濟可行的。

近來，微生物細胞工廠被廣泛的應用于化合物的生產。目前，在微生物中表達瓦倫烯合酶可以實現在微生物中瓦倫烯的異源合成，但是所能達到的產量水平還很低，其中所存在的主要因素即目前所存在的瓦倫烯合酶活性不高，往往需要配合復雜的代謝工程改造才能獲得較高的瓦倫烯產量。因此獲得高酶活的瓦倫烯合酶是實現瓦倫烯高產的一個主要因素。

發明內容

本發明的目的在于提供高性能的瓦倫烯合酶突變體及其在生產瓦倫烯中的應用。本發明的目的還在于提供一種瓦倫烯高產菌株以及實現瓦倫烯產量提升的方法。

為了實現上述目的，本發明提供下述技術方案：

本發明提供了瓦倫烯合酶突變體，其野生型為序列如SEQ?ID?NO.1所示的來源于刺芹Eryngium?glaciale的瓦倫烯合酶，與該野生型瓦倫烯合酶相比，所述的瓦倫烯合酶突變體含有下述突變位點的任一種：(1)I533V、R336K；(2)I533V、R336K、H196R、D176E；(3)I533V、R336K、R306K；(4)I533V、R336K、K325E；(5)I533V、R336K、H196R、D176E、R306K、K325E。

本發明還提供了編碼上述瓦倫烯合酶突變體的基因，所述的基因的核苷酸序列可以根據宿主密碼子偏愛性進行優化。

本發明還提供了含有上述基因的重組質粒，所述的重組質粒轉入到宿主細胞后可表達上述瓦倫烯合酶突變體。

本發明還提供了含有上述基因的重組細胞，所述的重組細胞的宿主包括細菌、真菌。

上述瓦倫烯合酶突變體、基因、重組質粒或重組細胞在生產瓦倫烯、諾卡酮中的應用。

本發明還提供了一種瓦倫烯高產菌株，所述的瓦倫烯高產菌株含有上述編碼瓦倫烯合酶突變體的基因。

在一些實施方案中，所述的瓦倫烯高產菌株含有編碼法尼基焦磷酸合酶的基因ERG20。

在一些實施方案中，所述的瓦倫烯高產菌株含有甲羥戊酸途徑(MVA途徑)基因，所述的MVA途徑基因包括：編碼乙酰乙酰輔酶A硫解酶的基因ERG10，編碼HMG-CoA合酶的基因ERG13，編碼HMG-CoA還原酶的基因tHMG1，編碼甲羥戊酸激酶的基因ERG12，編碼甲羥戊酸-5-磷酸激酶的基因ERG8，編碼甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶的基因MVD1，編碼異戊二烯焦磷酸異構酶的基因IDI1。

在一些實施方案中，所述的瓦倫烯高產菌株中，MVA途徑基因法尼烯焦磷酸合酶基因的拷貝數為ERG10、ERG13、tHMG1、ERG12、ERG8、MVD1、IDI1、ERG20＝2、2、3、2、2、2、2、2，編碼瓦倫烯合酶突變體的基因的拷貝數為2。

在一些實施方案中，所述的瓦倫烯高產菌株的宿主為釀酒酵母。

在一些實施方案中，所述的瓦倫烯高產菌株的宿主為釀酒酵母時，其敲除了GAL80基因。