[發明專利]一種用于分子診斷的EGFR vIII重排的DNA標準品、RNA標準品及其應用

在審

• 申請號: 202210026401.9
• 申請日: 2022-01-11
• 公開（公告）號: CN114381523A
• 公開（公告）日: 2022-04-22
• 發明（設計）人: 蔣濤華;傅堅剛;邵悅
• 申請（專利權）人: 仁寬（上海）生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12N15/11
• 代理公司: 北京睿智保誠專利代理事務所(普通合伙) 11732
• 代理人: 周新楣

本發明涉及基因重排標準品技術領域，本發明提供了一種用于分子診斷的EGFR vIII重排的DNA標準品、RNA標準品及其應用。本發明是將針對EGFR?E1基因的1號內含子的sgRNA構建到載體pX330上，得到質粒E1?2，將針對EGFR?E7基因的7號內含子的sgRNA構建到載體pX330上，得到質粒E7?3，將質粒E1?2和質粒E7?3共同轉染宿主細胞，得重組細胞，再對重組細胞進行單克隆化，得到制備DNA標準品或RNA標準品的細胞，進而得到DNA和RNA標準品。本發明提供的EGFR vIII重排標準品序列和細胞，樣品可以穩定長期提供，非常適用于LDT或IVD開發的性能評價和長期的質控需求。

技術領域

本發明涉及基因重排標準品技術領域，尤其涉及一種用于分子診斷的EGFR vIII重排的DNA標準品、RNA標準品及其應用。

背景技術

表皮生長因子受體(EGFR/ErbB1/HER1)是酪氨酸激酶受體家族的成員，還包括ErbB2/HER2/Neu、ErbB3/HER3和ErbB4/HER4。所有這些受體都是跨膜糖蛋白，分子量范圍從170kDa到185kDa。通常，它的激活涉及配體結合和隨后的受體二聚化。EGF受體的激活可在Ras/Raf/MAPK、PI3K/AKT、JAK/STAT或PLC/PKC通路中誘導信號，對多種細胞過程產生影響，包括增殖、代謝、凋亡、細胞存活或分化。信號級聯的終止發生在受體內化后，主要是網格蛋白依賴性內吞作用，導致其進入早期內體。此外，受體可能被轉運回細胞膜或在晚期內體和溶酶體中降解。

編碼EGFR的基因位于7號染色體(p11.2)的短臂上，由28個外顯子組成。成熟的EGFR蛋白(1186個氨基酸)由前體蛋白(1210個氨基酸)在去除N末端部分后形成。從N到C末端，EGFR由參與配體結合和受體二聚化的胞外域(外顯子1-16)、疏水跨膜域(外顯子17)和具有酪氨酸激酶活性的胞內域組成，其兩側是接頭區域和受體的C端部分(外顯子18-28)。細胞內結構域的20個酪氨酸殘基中有12個被證明經歷了磷酸化，這些結合受體激活后募集的膜結合或細胞質效應蛋白。

膠質母細胞瘤(GBM)是成人中最常見的惡性腦腫瘤，也是所有癌癥中最致命的，目前的治療方法：手術、放療和化療，中位生存期僅為12-15個月。

在GBM中，EGFR擴增在大多數情況下伴有基因重排。此類改變涉及特定外顯子或外顯子部分的缺失，并被指定為EGFR vI(N末端部分缺失)、EGFR vII(外顯子14和15缺失)、EGFR vIII(外顯子2-7缺失)、EGFR vIV(外顯子25-27缺失)和EGFR vV(外顯子25–28缺失)。

在膠質母細胞瘤(GBM)中，最常檢測到的變異之一是EGFR vIII。大約50％的GBM患者中EGFR發生了擴增，大約50-60％的擴增中同時伴隨有EGFR vIII重排。EGFR vIII的出現是由于EGFR外顯子2-7的缺失，產生了一個能夠組成型EGFR激活的截短的細胞外結構域。截短的細胞外結構域產生了一個新的肽序列，從而產生了獨特的、GBM細胞特異性、抗體反應性EGFR vIII抗原。其中，EGFR WT和EGFR vIII的結構示意圖如圖1所示。

在GBM的診斷中，NCCN指南提到了EGFR amplification和EGFR mutation，EGFRvIII的突變可以既稱為EGFR mutation，又經常會導致EGFR的擴增，因此是一個重要的診斷指標。其中，NCCN-2021第二版中樞神經系統腫瘤分子標志物截圖如圖2所示。

近些年來，國內出現很多公司去開發檢測EGFR vIII的試劑盒，在試劑盒的開發中，需要有標準品對整個檢測體系做性能評價，按照第三類醫療器械腫瘤檢測試劑盒開發的指導原則上描述，用于實驗性能評價需要對應的標準品，標準品不能是質粒，最好是臨床樣本。但是在實際檢測過程中，臨床樣本往往是可遇不可求的，需要正好碰到這樣的病人，而且樣本不可再生，量較少，不適合作為IVD試劑盒開發長期使用的標準品、質控品。