[發明專利]瓜蔞斑駁花葉病毒及其侵染性克隆載體、構建方法和應用

有效

• 申請號: 202210023201.8
• 申請日: 2022-01-10
• 公開（公告）號: CN114317460B
• 公開（公告）日: 2023-10-13
• 發明（設計）人: 楊秀玲;周雪平;陳誠
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12N15/84;C12N15/66;C12N1/21;C12Q1/70;C12R1/01;C12R1/94
• 代理公司: 北京東方尚禾專利代理事務所(特殊普通合伙) 11844
• 代理人: 李厚銘

本發明公開了瓜蔞斑駁花葉病毒及其侵染性克隆載體、構建方法和應用，所述瓜蔞斑駁花葉病毒的微生物保藏編號為CGMCC NO：21930，其序列如SEQ ID NO:15所示。該病毒的侵染性克隆載體由瓜蔞斑駁花葉病毒的全序列融合到帶35S啟動子和核酶Rz的載體pCB301制備得到。通過農桿菌介導轉化后在寄主體內轉錄、復制、侵染，以用于病毒的功能基因組研究。本發明為研究該病毒的基因組結構和功能以及病毒與寄主之間的相互作用提供了成熟的體系。

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，特別是涉及一種煙草花葉病毒屬新病毒，瓜蔞斑駁花葉病毒(Trichosanthes mottle mosaic virus，TrMMV)及其侵染性克隆載體、構建和應用。

背景技術

瓜蔞是我國重要的中藥材，瓜蔞的果實、果皮、種子和根等幾乎所有部位都具有藥理活性。在臨床治療中，瓜蔞在胸腔梗阻、心絞痛、心力衰竭、心肌梗死、肺心病、腦缺血等疾病的治療中具有重要作用。此外，現代藥理試驗也證實了其在抗腫瘤、抗氧化、神經保護、降血脂、減輕腎臟損傷等方面的藥理作用。隨著栽培規模的擴大，瓜蔞易受到多種病蟲害的危害，前期研究表明瓜蔞可受瓜類溫和花葉病毒(cucurbit mild mosaic virus，CuMMV)和瓜蔞相關彈狀病毒(Trichosanthes associated rhabdovirus 1，TRARV1)的侵染。

植物病毒的侵染性cDNA克隆是研究RNA病毒致病性極為有力的工具，也是研究這些病原的反向遺傳學基礎。植物病毒的侵染性克隆易于操作，被廣泛用于病毒的侵染機理、基因功能，以及病毒與宿主的相互作用等研究。目前已有一系列植物病毒侵染性克隆的方法，受植物病毒特性影響，所選擇的構建策略也有所差異。在構建策略方面，有體外轉錄法(利用T3，T7或SP6啟動子(噬菌體的RNA聚合酶)體外轉錄)和體內轉錄法(通過花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子實現體內轉錄)的構建方法；部分病毒具有保守的表達特性，需要準確、完整的序列才能實現表達；而在序列擴增、重組轉化過程中的堿基突變、片段缺失等都會對結果造成影響。

發明內容

本發明的第一目的是提供一種瓜蔞斑駁花葉病毒。發明人研究團隊通過小RNA測序，從產生花葉、斑駁癥狀的瓜蔞葉片中鑒定出一種煙草花葉病毒屬的新病毒，結合病毒的全基因組特征，將其暫命名為瓜蔞斑駁花葉病毒(Trichosanthes mottle mosaic virus，TrMMV)，由于該新病毒的未知性和其對瓜蔞的潛在威脅，需要加強對該病毒的研究。

本發明的第二目的是提供一種瓜蔞斑駁花葉病毒的侵染性克隆載體及其構建方法和應用。本發明基于對一個侵染瓜蔞的全新病毒進行基因組獲得，在基因重組、片段插入、質粒轉化等方面進行了優化，最終獲得在植物中高效表達的病毒侵染性克隆載體。

本發明在獲得瓜蔞斑駁花葉病毒基因組全序列的基礎上，構建了該病毒的侵染性克隆，瓜蔞斑駁花葉病毒的全長cDNA序列插入到含有35S啟動子的植物雙元表達載體pCB301中，通過農桿菌介導轉化后在寄主體內轉錄、復制、侵染，以用于病毒的功能基因組研究。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案具體如下：

一種瓜蔞斑駁花葉病毒，其微生物保藏編號為CGMCC NO：21930。其序列如SEQ IDNO:15所示。

基于上述瓜蔞斑駁花葉病毒的侵染性克隆載體，由瓜蔞斑駁花葉病毒TrMMV全序列融合到帶35S啟動子和核酶Rz的載體pCB301制備得到。

該瓜蔞斑駁花葉病毒的侵染性克隆載體的制備方法，包括以下的步驟：

(1)獲得瓜蔞斑駁花葉病毒TrMMV全基因組序列﹔