[發明專利]瓜蔞斑駁花葉病毒及其侵染性克隆載體、構建方法和應用

有效

• 申請號: 202210023201.8
• 申請日: 2022-01-10
• 公開（公告）號: CN114317460B
• 公開（公告）日: 2023-10-13
• 發明（設計）人: 楊秀玲;周雪平;陳誠
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12N15/84;C12N15/66;C12N1/21;C12Q1/70;C12R1/01;C12R1/94
• 代理公司: 北京東方尚禾專利代理事務所(特殊普通合伙) 11844
• 代理人: 李厚銘

1.一種瓜蔞斑駁花葉病毒，其微生物保藏編號為CGMCC NO：21930。

2.根據權利要求1所述的瓜蔞斑駁花葉病毒，其特征在于：其序列如SEQ ID NO:15所示。

3.權利要求1或2所述的瓜蔞斑駁花葉病毒的侵染性克隆載體，其特征在于：由瓜蔞斑駁花葉病毒的全序列融合到帶35S啟動子和核酶Rz的載體pCB301制備得到。

4.根據權利要求3所述的瓜蔞斑駁花葉病毒的侵染性克隆載體的構建方法，其特征在于：包括以下的步驟：

(1)獲得瓜蔞斑駁花葉病毒TrMMV的全基因組序列﹔

(2)設計具有20bp重疊區域的兩對引物TrMMV-insert1F/TrMMV-insert1R，TrMMV-insert2F/TrMMV-insert2R，以受病毒侵染的瓜蔞cDNA為模板，分兩段擴增TrMMV的基因組，TrMMV-insert1F/TrMMV-insert1R擴增獲得的片段為TrMMV-insert1，TrMMV-insert2F/TrMMV-insert2R擴增獲得的片段為TrMMV-insert2；

所述引物TrMMV-insert1F，TrMMV-insert1R，TrMMV-insert2F，TrMMV-insert2R的序列分別如SEQ ID No：1-4所示；

(3)選用StuI和BamHI雙酶切pCB301載體，pCB301的酶切產物與步驟(2)獲得的擴增片段進行切膠回收純化，純化產物進行同源重組反應，連接產物轉化進大腸桿菌后，篩選插入目的片段的陽性單克隆，進一步測序驗證，從而獲得具有TrMMV全基因組序列的克隆pCB301-TrMMV；

(4)過夜培養含pCB301-TrMMV質粒的大腸桿菌，提取質粒，獲得瓜蔞斑駁花葉病毒的侵染性克隆載體。

5.根據權利要求4所述的瓜蔞斑駁花葉病毒的侵染性克隆載體的構建方法，其特征在于：所述步驟(1)具體包括：

1.1)提取產生花葉、斑駁、褪綠等疑似受病毒侵染的瓜蔞植物病葉的總RNA，將樣品進行小RNA測序；

1.2)TrMMV近全長基因組序列的擴增：根據小RNA測序結果組裝的Contigs，結合近緣病毒的保守序列，設計具有重疊區域的三對引物GL1F/GL1R，GL2F/GL2R，GL3F/GL3R，如SEQ IDNo：5-10所示，以瓜蔞病葉RNA反轉錄的cDNA為模板進行PCR擴增，擴增產物經膠回收純化，連接到pEasy-Blunt載體，轉化到大腸桿菌細胞中提取質粒，測序，序列拼接后獲得TrMMV的近全長核苷酸序列；

PCR擴增體系為：10μL 5×TransStart FastPfu Buffer、4μL 2.5mM dNTPs、上下游引物10μM各1μL、1μL cDNA模板、1μL TransStart FastPfu DNA Polymerase，32μL ddH₂O，總反應體系為50μL；各片段的反應條件為：95℃3min；95℃30s，55℃30s，72℃3min，35個循環；72℃8min；

1.3)RACE：根據獲得的TrMMV近全長核苷酸序列，設計引物5’RACE-GSP1、3’RACE-GSP2、5’RACE-NGSP3、3’RACE-NGSP4，如SEQ ID No：11-14所示；通過5’和3’反應擴增后，產物連接到pRACE載體，進而轉化到大腸桿菌細胞中提取質粒測序，5’和3’測序結果與步驟1.2)所得序列拼接獲得TrMMV全序列。