[發明專利]一種利用細胞工程技術創制小麥耐熱突變體的方法

在審

• 申請號: 202210021312.5
• 申請日: 2022-01-10
• 公開（公告）號: CN114342802A
• 公開（公告）日: 2022-04-15
• 發明（設計）人: 李國良;郭秀林;劉子會;張紅梅;張艷敏;張華寧;段碩楠;孟祥照
• 申請（專利權）人: 河北省農林科學院生物技術與食品科學研究所
• 主分類號: A01H1/08
• 分類號: A01H1/08;A01H4/00
• 代理公司: 北京鑫瑞森知識產權代理有限公司 11961
• 代理人: 王立普

本發明屬于細胞工程技術領域，尤其涉及一種利用細胞工程技術創制小麥耐熱突變體的方法。本發明利用NaN₃誘變處理小麥幼穗，通過組織培養技術誘導幼穗愈傷組織，對愈傷組織進行三輪致死性熱處理，然后再經過組織培養技術分化、生根、出苗，最終成功獲得小麥耐熱突變體。NaN₃易于透過細胞膜進入細胞，以堿基替換方式影響DNA合成，造成點突變，并且只作用于復制中的DNA，染色體畸變概率低。采用逐步升高致死性熱處理溫度處理幼穗愈傷組織，既篩選出耐熱突變體，又防止愈傷組織全部死亡。本發明不經過農桿菌侵染，不用轉基因，不存在生物安全性問題，是一種比體細胞雜交和遺傳轉化更為便利和經濟的生物技術。

技術領域

本發明屬于細胞工程技術領域，尤其涉及一種利用細胞工程技術創制小麥耐熱突變體的方法。

背景技術

利用組織培養過程中自發產生的無性系變異，或組織培養過程中人為誘導增加變異，是作物品種改良的有效途徑，它是一種比體細胞雜交和遺傳轉化更為便利和經濟的生物技術。對培養物進行物理(輻射)和化學誘變可以增加變異發生頻率和變異種類。在理論上，組織培養可為誘導和選擇各類突變體創造豐富的變異來源。在小麥上，無性系變異的類型包括株高、株型、熟期、分蘗力、穗粒數、千粒重等農藝性狀(王培等,1996,余毓君等,1997)，蛋白質含量、麥谷蛋白亞基構成、面團形成時間及SDS沉淀值等品質性狀(朱至清等,1992,王培等,1995,張艷敏等,2002)，還有耐鹽、抗旱、抗除草劑、抗病等抗逆性狀(肖海林等,1989,裴翠娟等,1991,郭麗娟等,1996)。在實踐上，體細胞耐熱無性系變異的離體篩選在烏菜、不結球白菜、菜心、非洲菊、瓜葉菊、馬鈴薯等多物種上獲得成功(于曉英等,2007,寧志怨等,2009)。梁雪蓮等(2010)以甜、糯玉米的幼胚為材料，在愈傷誘導、繼代及分化培養各階段進行高溫脅迫處理，結果經熱逆境篩選出的愈傷組織與幼苗的耐熱生理指標優于對照，暗示獲得了預期的耐熱無性系變異。

但是目前尚未見通過組織培養獲得耐熱性小麥的相關報道，小麥耐熱變異誘導與選擇的相關理論亟需進一步研究，小麥耐熱變異誘導與選擇相關的技術問題亟需解決。

發明內容

本發明利用NaN₃誘變處理小麥幼穗，通過組織培養技術誘導幼穗愈傷組織，對愈傷組織進行三輪致死性熱處理，然后再經過組織培養技術分化、生根、出苗，最終成功獲得小麥耐熱突變體。本發明不經過農桿菌侵染，不用轉基因，不存在生物安全性問題，是一種比體細胞雜交和遺傳轉化更為便利和經濟的生物技術。

本發明為了實現上述目的采用了如下技術方案。

本發明提供了一種利用細胞工程技術創制小麥耐熱突變體的方法，具體步驟如下：(1)選取小麥幼穗：取小麥小穗原基分化期的幼穗；(2)NaN₃誘變處理：將步驟(1)中所述小麥幼穗在NaN₃溶液中浸泡0.5～1.5小時，無菌水沖洗4～6次；(3)制備固體培養基；(4)誘導培養愈傷組織：將步驟(2)中所述誘變處理后的小麥幼穗在無菌條件下接種到步驟(3)中制備的固體培養基上，進行愈傷組織誘導培養；(5)多輪高溫選擇壓熱處理：將步驟(4)中所述的愈傷組織利用42℃～44.5℃之間的溫度進行三輪高溫選擇壓熱處理，再經過組織培養技術分化、生根、出苗；(6)獲得與篩選耐熱突變體：將步驟(5)中獲得的幼苗3～5℃春化20～40d，然后移栽到盛有營養土的花盆中獲得耐熱突變體；將收獲的突變體種子種到熱棚中，在小麥開花期和灌漿期覆棚熱處理，收獲種子后測定千粒重，選定處理組千粒重高于對照組30株千粒重平均值20％的突變體，每個突變體即為一個耐熱突變系；所述對照組為未經過誘變，未經過三輪熱處理，但在開花期和灌漿期覆，與突變體一起進行棚熱處理得到的小麥千粒重；所述對照組30株是為了減少單株千粒重誤差選取的小樣本。

優選的，所述步驟(1)中取小麥小穗原基分化期2～3mm的幼穗。

優選的，所述步驟(2)中配制的NaN₃溶液設置6個不同的濃度：0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0mmol L^-1。