[發明專利]一種利用細胞工程技術創制小麥耐熱突變體的方法

在審

• 申請號: 202210021312.5
• 申請日: 2022-01-10
• 公開（公告）號: CN114342802A
• 公開（公告）日: 2022-04-15
• 發明（設計）人: 李國良;郭秀林;劉子會;張紅梅;張艷敏;張華寧;段碩楠;孟祥照
• 申請（專利權）人: 河北省農林科學院生物技術與食品科學研究所
• 主分類號: A01H1/08
• 分類號: A01H1/08;A01H4/00
• 代理公司: 北京鑫瑞森知識產權代理有限公司 11961
• 代理人: 王立普

1.一種利用細胞工程技術創制小麥耐熱突變體的方法，其特征在于，具體步驟如下：

(1)選取小麥幼穗：取小麥小穗原基分化期的幼穗；

(2)NaN₃誘變處理：將步驟(1)中所述小麥幼穗在NaN₃溶液中浸泡0.5～1.5小時，無菌水沖洗4～6次；

(3)制備固體培養基；

(4)誘導培養愈傷組織：將步驟(2)中所述誘變處理后的小麥幼穗在無菌條件下接種到步驟(3)中制備的固體培養基上，進行愈傷組織誘導培養；

(5)多輪高溫選擇壓熱處理：將步驟(4)中所述的愈傷組織利用42℃～44.5℃之間的溫度進行三輪高溫選擇壓熱處理，再經過組織培養技術分化、生根、出苗；

(6)獲得與篩選耐熱突變體：

將步驟(5)中獲得的幼苗3～5℃春化20～40d，然后移栽到盛有營養土的花盆中獲得耐熱突變體；

將收獲的突變體種子種到熱棚中，在小麥開花期和灌漿期覆棚熱處理，收獲種子后測定千粒重，選定處理組千粒重高于對照組30株千粒重平均值20％的突變體，每個突變體即為一個耐熱突變系；

所述對照組為未經過誘變，未經過三輪熱處理，但在開花期和灌漿期，與突變體一起進行棚熱處理得到的小麥千粒重；所述對照組30株是為了減少單株千粒重誤差選取的小樣本。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中取小麥小穗原基分化期2～3mm的幼穗。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中配制的NaN₃溶液設置6個不同的濃度：0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0mmol L^-1。

4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中配制的NaN₃溶液設置3個不同的濃度：3.0，4.0，5.0mmol L^-1。

5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(5)的具體操作過程如下：

第一輪熱處理：將步驟(4)中培養得到的愈傷組織42℃熱處理24小時，然后將其轉移至MS繼代培養基上25℃溫室恢復培養2周；

第二輪熱處理：將經過第一輪熱處理的愈傷組織43℃熱處理24小時，然后將其轉移至MS繼代培養基上25℃溫室恢復培養20天，接著將生長狀態良好的愈傷組織轉移至MS繼代培養基上；

第三輪熱處理：將經過第二輪熱處理的愈傷組織44.5℃熱處理24小時，然后將生長狀態良好的愈傷組織轉移至MS分化培養基上分化培養20天，接著將分化苗轉移至MS生根壯苗培養基上。

6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述第一輪熱處理中使用的愈傷組織是培養6周的小麥幼穗愈傷組織。

7.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述繼代培養基的組成是在1×MS培養基大量元素、微量元素、有機元素以及鐵鹽的基礎上，再加入蔗糖50g L^-1，瓊脂5g L^-1以及2,4-D2mg L^-1，pH為5.8。

8.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述分化培養基的組成是在1×MS培養基大量元素、微量元素、有機元素以及鐵鹽的基礎上，再加入蔗糖50g L^-1，瓊脂5g L^-1，KT 0.6mgL^-1以及NAA 0.4mg L^-1，pH為5.8。

9.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述生根壯苗培養基的組成是在1/2×MS培養基大量元素、微量元素、有機元素以及鐵鹽的基礎上，再加入蔗糖30g L^-1，瓊脂5g L^-1，KT0.5mg L^-1，NAA 0.5mg L^-1以及多效唑3mg L^-1，pH為5.8。

10.權利要求1～9任一所述方法在創制小麥耐熱突變體中的應用。