[發(fā)明專利]一種快速檢測(cè)循環(huán)腫瘤DNA基因突變的方法、系統(tǒng)及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210020894.5
• 申請(qǐng)日: 2022-01-10
• 公開（公告）號(hào): CN114250304B
• 公開（公告）日: 2023-08-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 易鋼;張文秀;趙書慧
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 重慶醫(yī)科大學(xué)國(guó)際體外診斷研究院
• 主分類號(hào): C12Q1/6886
• 分類號(hào): C12Q1/6886;C12N15/11
• 代理公司: 重慶渝之知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 50249
• 代理人: 柴社英

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥分析技術(shù)領(lǐng)域，具體公開了一種快速檢測(cè)循環(huán)腫瘤DNA基因突變的方法、系統(tǒng)及其應(yīng)用。本發(fā)明以BRAF?V600E基因序列作為體外生物標(biāo)志物，建立了基于三維DNA步行器和CRISPR/Cas12a的熒光檢測(cè)策略。所述方法包括：采用三維DNA步行器識(shí)別和結(jié)合靶DNA，在核酸內(nèi)切酶驅(qū)動(dòng)下循環(huán)剪切軌道鏈S，產(chǎn)生的輸出鏈OD與crRNA特異性結(jié)合，并激活Cas12a的非特異性反式裂解活性，從而切割信號(hào)報(bào)告分子，產(chǎn)生熒光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明提供了一個(gè)快速、靈敏、特異性好的ctDNA檢測(cè)平臺(tái)，在早期臨床診斷和生物醫(yī)學(xué)研究方面具有良好的潛力。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥分析技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種快速檢測(cè)循環(huán)腫瘤DNA基因突變的方法、系統(tǒng)及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

癌癥是全球第二大死亡原因。據(jù)估計(jì)，到2030年，癌癥病例數(shù)將增加到2460萬，癌癥死亡人數(shù)將增加到1300萬。因此，早期診斷和治療癌癥對(duì)于降低癌癥死亡率具有重要意義。常見的腫瘤標(biāo)記物包括蛋白質(zhì)，如癌胚蛋白、甲胎蛋白和前列腺特異性抗原，以及調(diào)節(jié)致癌基因的各種RNA和DNA。其中，直接來源于腫瘤或循環(huán)腫瘤細(xì)胞的循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)在外周血中以單鏈或雙鏈DNA形式存在。ctDNA不僅在化學(xué)和生化穩(wěn)定性方面優(yōu)于RNA，而且比循環(huán)腫瘤細(xì)胞更容易從血液中分離出來，對(duì)檢測(cè)更敏感。值得注意的是，ctDNA攜帶導(dǎo)致異常細(xì)胞增殖或分化的基因突變，提供了關(guān)于腫瘤分子特征的準(zhǔn)確信息，并被認(rèn)為可以用于監(jiān)測(cè)較長(zhǎng)半衰期的腫瘤狀態(tài)。

目前，已有報(bào)道稱多種ctDNA與不同的癌癥密切相關(guān)。特別是超過80％的甲狀腺乳頭狀癌患者的病例特征是位于人類7號(hào)染色體上的BRAF基因(V-raf小鼠肉瘤病毒癌基因同源基因B1)發(fā)生突變。BRAF?V600E突變是指胸腺苷啶在1799核苷酸位置轉(zhuǎn)化為腺嘌呤，導(dǎo)致600處殘基纈氨酸取代為谷氨酸。研究表明，BRAF?V600E突變與甲狀腺乳頭狀癌的侵襲性行為、疾病復(fù)發(fā)和疾病特異性死亡率相關(guān)。因此，迫切需要一種敏感的技術(shù)來實(shí)現(xiàn)BRAF?V600E的早期檢測(cè)，以防止腫瘤的進(jìn)展。

傳統(tǒng)的檢測(cè)ctDNA的分析技術(shù)包括聚合酶鏈反應(yīng)、DNA測(cè)序、表面增強(qiáng)拉曼散射和DNA離合器探針等。然而，由于外周血中ctDNA豐度低，這些方法存在操作繁瑣、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、成本高、易受生物環(huán)境干擾、假陽性或假陰性率高等局限性。

近年來，快速、簡(jiǎn)單的比色法、化學(xué)發(fā)光法、電化學(xué)法、電化學(xué)發(fā)光法等檢測(cè)方法已被廣泛應(yīng)用于核酸的檢測(cè)。其中，利用不同擴(kuò)增策略的熒光方法(包括滾環(huán)擴(kuò)增、鏈置換擴(kuò)增和DNA分子機(jī)器等)受到了研究者越來越多的關(guān)注。例如，有研究團(tuán)隊(duì)提出了一種新的基于流式細(xì)胞術(shù)的傳感策略，結(jié)合了無酶擴(kuò)增和磁分離技術(shù)。但是這些方法仍存在不穩(wěn)定性和易受環(huán)境干擾等缺點(diǎn)。

因此，仍需不斷的進(jìn)行研究，以開發(fā)出一種操作簡(jiǎn)單、方便快捷、穩(wěn)定性好、不易受環(huán)境干擾、精確度高的ctDNA檢測(cè)手段。

發(fā)明內(nèi)容

鑒于以上所述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的在于提供一種快速檢測(cè)循環(huán)腫瘤DNA基因突變的方法、系統(tǒng)及其應(yīng)用，用于解決現(xiàn)有技術(shù)中ctDNA檢測(cè)方法操作復(fù)雜、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、易受生物環(huán)境干擾、假陽性或假陰性率高等問題。

為實(shí)現(xiàn)上述目的及其他相關(guān)目的，本發(fā)明第一方面提供一種快速檢測(cè)循環(huán)腫瘤DNA基因突變的方法，包括如下步驟：采用三維DNA步行器識(shí)別和結(jié)合靶DNA，在核酸內(nèi)切酶驅(qū)動(dòng)下循環(huán)剪切軌道鏈S，產(chǎn)生的輸出鏈OD與crRNA特異性結(jié)合，并激活Cas12a的非特異性反式裂解活性，從而切割信號(hào)報(bào)告分子，產(chǎn)生熒光信號(hào)，以檢測(cè)循環(huán)腫瘤DNA基因突變。

進(jìn)一步，所述循環(huán)腫瘤DNA基因突變?yōu)檠h(huán)腫瘤DNA?BRAF?V600E基因突變，即所述靶DNA，所述靶DNA序列如SEQ?ID?NO.3所示。

進(jìn)一步，所述三維DNA步行器包括包括步行鏈DW、軌道鏈S，以核酸內(nèi)切酶為驅(qū)動(dòng)力，所述步行鏈DW序列如SEQ?ID?NO.1所示：