[發明專利]一種快速檢測循環腫瘤DNA基因突變的方法、系統及其應用

有效

• 申請號: 202210020894.5
• 申請日: 2022-01-10
• 公開（公告）號: CN114250304B
• 公開（公告）日: 2023-08-04
• 發明（設計）人: 易鋼;張文秀;趙書慧
• 申請（專利權）人: 重慶醫科大學國際體外診斷研究院
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12N15/11
• 代理公司: 重慶渝之知識產權代理有限公司 50249
• 代理人: 柴社英

1.一種檢測循環腫瘤DNA基因突變的檢測試劑，其特征在于，所述循環腫瘤DNA基因突變為循環腫瘤DNA?BRAF?V600E基因突變，突變的靶DNA序列如SEQ?ID?NO.3所示；所述檢測采用三維DNA步行器識別和結合靶DNA，在核酸內切酶驅動下循環剪切軌道鏈S，產生的輸出鏈OD與crRNA特異性結合，并激活Cas12a的非特異性反式裂解活性，從而切割信號報告分子，產生熒光信號，以檢測循環腫瘤DNA基因突變；

所述三維DNA步行器包括步行鏈DW、軌道鏈S，以核酸內切酶為驅動力，所述步行鏈DW序列如SEQ?ID?NO.1所示，所述軌道鏈S序列如SEQ?ID?NO.2所示，所述核酸內切酶為限制性核酸內切酶Nb.BbvCI；

所述crRNA序列如SEQ?ID?NO.4所示；

所述信號報告分子序列如SEQ?ID?NO.5所示，所述信號報告分子的5’端修飾有熒光基團，3’端修飾有淬滅基團。

2.根據權利要求1所述的檢測試劑，其特征在于：還包括CRISPR/Cas12a熒光反應系統，所述CRISPR/Cas12a熒光反應系統包含：Cas12a、CRISPR·crRNA、10×NEBuffer、信號報告分子Reporter和RNase抑制劑。

3.根據權利要求1或2所述的檢測試劑，其特征在于，通過如下步驟制備：

(1)將生物素修飾的步行鏈DW變性后形成發夾結構，然后將生物素修飾的軌道鏈S和發夾狀DW加入到含鏈霉親和素磁珠的結合緩沖液中，孵育形成DW-S-MBs混合液；接著用TE緩沖液通過磁分離洗滌磁珠，并用TE緩沖液重懸后形成純化的DW-S-MBs溶液；

(2)將DW-S-MBs純化溶液、靶DNA、限制性核酸內切酶、限制性核酸內切酶緩沖液混合反應，以觸發三維DNA步行器擴增反應；

(3)使用磁分離后的上清液觸發CRISPR/Cas12a熒光反應系統，并滅活Cas12a蛋白；

(4)最后通過測量熒光信號強度獲得靶DNA的濃度。

4.根據權利要求3所述的檢測試劑，其特征在于：所述步驟(1)中，將生物素修飾的步行鏈DW在95℃水浴條件下變性，形成發夾結構；

和/或，所述步驟(1)中，軌道鏈S和發夾狀DW的摩爾比為(5～40)：1；

和/或，所述步驟(1)中，將生物素修飾的軌道鏈S和發夾狀DW加入到含鏈霉親和素磁珠的結合緩沖液中，在金屬浴中振蕩孵育形成DW-S-MBs混合液；

和/或，所述步驟(1)中，孵育溫度為37℃，孵育時間為30～60分鐘；

和/或，所述步驟(1)中，所述結合緩沖液包含以下成分：20mM?Tris、1M?NaCl、1mMEDTA、pH?7.5，0.0005％TritonX·100；

和/或，所述步驟(1)中，所述TE緩沖液包含以下成分：10mmol?L^-1Tris·HCl，1mmolL^-1EDTA，pH?8.0；

和/或，所述步驟(1)中，所述含鏈霉親和素磁珠的結合緩沖液制備方法包括如下步驟：

將鏈霉親和素磁珠原液用結合緩沖液洗滌，然后將洗滌過的磁珠懸浮在結合緩沖液中。

5.根據權利要求3所述的檢測試劑，其特征在于：所述步驟(2)中，限制性核酸內切酶的濃度為5～15U；

和/或，所述步驟(2)中，反應時間為20～60分鐘。

6.根據權利要求3所述的檢測試劑，其特征在于：所述步驟(3)中，所述CRISPR/Cas12a熒光反應系統包含：Cas12a、CRISPR·crRNA、10×NEBuffer、信號報告分子Reporter和RNase抑制劑；

和/或，所述步驟(3)包括如下步驟：使用經過磁分離后的上清液觸發CRISPR/Cas12a熒光反應系統，在37℃孵育25分鐘，然后在95℃下終止反應5分鐘，以滅活Cas12a；和/或，所述步驟(4)中，使用熒光分光光度計測量熒光信號強度，測量參數為：激發波長525nm，發射波長范圍為540nm至640nm，激發和發射的狹縫分別設置為5nm和10nm，檢測電壓為600V，556nm處的熒光強度用來量化靶DNA的濃度。