[發明專利]一種制備肝功能可逆的永生化肝細胞的方法及其應用

有效

• 申請號: 202210019430.2
• 申請日: 2022-01-10
• 公開（公告）號: CN114085874B
• 公開（公告）日: 2022-04-29
• 發明（設計）人: 高毅;曾敏;晏正明;韓旭;翁駿
• 申請（專利權）人: 廣東乾暉生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N15/65;C12N5/10
• 代理公司: 北京超凡宏宇專利代理事務所(特殊普通合伙) 11463
• 代理人: 張金銘

本發明公開了一種制備肝功能可逆的永生化肝細胞的方法及其應用，涉及生物醫學領域。本發明將Tet?on系統應用于肝細胞，通過Tet?on系統使得肝細胞的功能得到強化。Tet?on系統具有高效率、精準、安全和可逆性的特點。進而由此制備了一種新型的永生化肝細胞，該肝細胞可以通過添加或去除四環素類似物實現肝細胞功能的可逆調控，促進肝細胞功能的可逆增強。該制備方法簡單易行，培養成本低，種子細胞來源于永生化肝細胞，易于臨床轉化。

技術領域

本發明涉及生物醫學領域，具體而言，涉及一種制備肝功能可逆的永生化肝細胞的方法及其應用。

背景技術

合適的肝細胞系在生物人工肝技術、藥理毒理學研究和肝臟組織工程研究中的地位越來越重要。理想的肝細胞源應具備完整的肝功能、良好的增殖能力以及無致瘤、無感染的風險。目前常用的肝細胞源有原代人肝細胞、原代豬肝細胞、人肝癌細胞系HepG2、HepaRG、永生化細胞以及干細胞分化肝細胞等。這些類肝細胞在體外雖然具有一定的肝功能，但是它們各自存在著成熟度不足、有限性擴增、功能不穩定、異種移植排斥、生物安全性不高和致瘤風險等應用障礙。

公開號為CN110438157B和公開號為CN105521482A的中國發明專利申請公開了，單獨或聯合應用不同的肝細胞特異性轉錄因子來進一步誘導類肝細胞分化的方法，但這些方法或種子細胞來源于肝癌細胞，或使用的培養體系成本高昂，皆難以進行臨床轉化。

公開號為CN105925609B和公開號為CN107557389A的中國發明專利申請公開了，通過可控誘導不同的目的外源基因過表達，來調控干細胞向不同的體細胞分化的方法。前者促進多能干細胞向造血細胞分化，后者則促進骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化。

鑒于此，特提出本發明。

發明內容

本發明的目的在于提供一種制備肝功能可逆的永生化肝細胞的方法及其應用以解決上述技術問題。

發明人將Tet-on系統應用于肝細胞，通過改進Tet-on系統使得肝細胞的功能得到強化。進而由此制備了一種新型的永生化肝細胞，該肝細胞可以通過添加或去除四環素類似物實現肝細胞功能的可逆調控，促進肝細胞可逆功能的增強。

本發明是這樣實現的：

本發明提供了一種制備肝功能可逆的永生化肝細胞的方法，將包裝后的含調控肝細胞轉錄的Tet-on系統的慢病毒感染人永生化肝細胞，然后利用篩選劑和擴增培養基對經病毒轉染后得到的細胞進行抗性篩選和擴增傳代培養，得到肝功能強化可逆的永生化肝細胞系；通過添加四環素類似物使得永生化肝細胞系呈肝向功能強化狀態，通過去除四環素類似物使得永生化肝細胞系呈正常肝細胞增殖狀態；

調控肝細胞轉錄的Tet-on系統包括調節表達盒和反應表達盒，調節表達盒包括肝臟特異性啟動子和反義四環素激活子，反應表達盒包括四環素誘導型啟動子和轉錄因子編碼基因；轉錄因子編碼基因包括但不限于FOXA3基因、CEBPA基因和GATA6基因。

本發明提供的肝功能可逆的永生化肝細胞的制備方法具有高效率、精準、安全和可逆性的特點。

高效率體現在：無誘導時目的基因表達水平較低，有四環素類似物誘導存在時，目的基因表達。目的基因包括轉錄因子編碼基因和篩選基因。具體表現為：四環素類似物不存在時，反義四環素激活子無法與TRE結合。由于反應表達盒缺少增強子，反義四環素激活子（reverse tetracycline tranional activator，rtTA）未與TRE結合時，四環素誘導型啟動子無法啟動目的基因的表達，從而表現為基因表達受抑制。四環素類似物存在時，反義四環素激活子能夠與TRE結合，從而使得四環素誘導型啟動子活化，從而使得目的基因表達。

精準調控體現為可以通過控制四環素類似物的劑量及用藥時間進行肝細胞功能強化的可逆調控。