[發明專利]一種制備肝功能可逆的永生化肝細胞的方法及其應用

有效

• 申請號: 202210019430.2
• 申請日: 2022-01-10
• 公開（公告）號: CN114085874B
• 公開（公告）日: 2022-04-29
• 發明（設計）人: 高毅;曾敏;晏正明;韓旭;翁駿
• 申請（專利權）人: 廣東乾暉生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N15/65;C12N5/10
• 代理公司: 北京超凡宏宇專利代理事務所(特殊普通合伙) 11463
• 代理人: 張金銘

1.一種制備肝功能可逆的永生化肝細胞的方法，其特征在于，將包裝后的含調控肝細胞轉錄的Tet-on系統的慢病毒感染人永生化肝細胞然后利用篩選劑和擴增培養基對經病毒轉染后的細胞進行抗性篩選和擴增傳代培養，得到肝功能可逆的永生化肝細胞系；通過添加四環素類似物使得永生化肝細胞系呈肝向功能強化狀態，通過去除四環素類似物使得永生化肝細胞系呈正常肝細胞增殖狀態；

所述調控肝細胞轉錄的Tet-on系統包括調節表達盒和反應表達盒，所述調節表達盒包括肝臟特異性啟動子和反義四環素激活子，所述反應表達盒包括四環素誘導型啟動子和轉錄因子編碼基因；所述轉錄因子編碼基因包括FOXA3基因、CEBPA基因和GATA6基因; 所述調節表達盒還包括第一篩選基因、轉錄后調控元件和銜接元件，且所述肝臟特異性啟動子、所述反義四環素激活子、銜接元件、第一篩選基因和轉錄后調控元件沿5’-3’方向依次串聯；

所述四環素誘導型啟動子、所述轉錄因子編碼基因沿5’-3’方向依次串聯，所述反應表達盒還包括第二篩選基因，所述第二篩選基因位于所述轉錄因子編碼基因的下游；

所述四環素類似物為金霉素、土霉素、米諾環素、多西環素或強力霉素。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述人永生化肝細胞是由人永生化肝細胞系作為基底種子細胞；在進行慢病毒感染前進行基底種子細胞的培養準備，所述基底種子細胞的培養準備包括：將人永生化肝細胞進行培養，以得到匯合率為50%-70%的基底種子細胞。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述包裝后的慢病毒與人永生化肝細胞的混合比例為：每5×10⁵數量的人永生化肝細胞與1×10⁷-2.5×10⁷數量的包裝后的慢病毒液混合。

4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，感染人永生化肝細胞48-72h后，換用含有篩選劑的培養基繼續再傳代培養；所述再傳代培養的代數為3-4代。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述篩選劑為嘌呤霉素、腐草霉素、殺稻瘟菌素、潮霉素或新霉素。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述肝臟特異性啟動子選自CMV啟動子、PGK啟動子、白蛋白啟動子、載脂蛋白E啟動子、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶啟動子、α-I-抗胰蛋白酶啟動子、甲狀腺激素結合球蛋白啟動子、α-甲胎蛋白啟動子、醇脫氫酶啟動子、IGF-II啟動子、因子VIII啟動子、HBV基礎核心蛋白啟動子、HBV前s2蛋白啟動子、甲狀腺素-結合球蛋白啟動子、HCR-Ap0CII的雜合啟動子、HCR-hAAT雜合啟動子、與小鼠白蛋白基因的增強子元件結合的AAT啟動子、低密度脂蛋白啟動子、丙酮酸激酶啟動子、卵磷脂-膽固醇酰基轉移酶啟動子、載脂蛋白H啟動子、鐵傳遞蛋白啟動子、甲狀腺素運載蛋白啟動子、α-纖維蛋白原及β-纖維蛋白原的啟動子、α-I-抗糜蛋白酶啟動子、α-2-HS糖蛋白啟動子、觸珠蛋白啟動子、血漿銅藍蛋白啟動子、血纖維蛋白溶酶原啟動子、補體蛋白啟動子、補體C3激活子的啟動子、血液結合素啟動子及α-I-酸性糖蛋白啟動子中的任意一種；

所述第一篩選基因選自嘌呤霉素抗性基因、腐草霉素抗性基因、殺稻瘟菌素抗性基因、潮霉素抗性基因或新霉素抗性基因。

7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二篩選基因選自真核抗性基因；

所述真核抗性基因選自嘌呤霉素抗性基因、腐草霉素抗性基因、殺稻瘟菌素抗性基因、潮霉素抗性基因或新霉素抗性基因。

8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述四環素誘導型啟動子選自TRE3G啟動子。

9.一種如權利要求1所述的調控肝細胞轉錄的Tet-on系統在制備肝功能可逆的永生化肝細胞中的應用。