[發明專利]一種人神經祖細胞分化方法及其在毒性測試中的應用

在審

• 申請號: 202210018602.4
• 申請日: 2022-01-08
• 公開（公告）號: CN114292815A
• 公開（公告）日: 2022-04-08
• 發明（設計）人: 章征保;楊穎;李慶;黃志彪;羅振奎;陳美芬;張秋歡;梁揚盛;彭寶瑩
• 申請（專利權）人: 廣東省疾病預防控制中心
• 主分類號: C12N5/0793
• 分類號: C12N5/0793;C12N5/0797;C12Q1/02
• 代理公司: 重慶以知共創專利代理事務所(普通合伙) 50226
• 代理人: 高建華

本發明屬于細胞生物學技術領域，提出了一種人神經祖細胞分化方法及其在毒性測試中的應用，包括如下步驟：S1:使用預冷槍頭吸取Matrigel，加入至預冷的Advanced DMEM/F12培養基稀釋，制成Matrigel包被液，并將Matrigel包被液預冷；S2:將預冷Matrigel包被液轉移至培養皿中，并放置于培養箱中靜置，得Matrigel包被培養皿；S3:將融合度達到70?80％的hNPC細胞，使用PBS洗滌，Accutase消化酶進行消化；S4:將離心管中的細胞離心去上清，采用NPC維持培養基并加入ROCK inhibitor重懸細胞后，接種于Matrigel包被培養皿中進行培養；S5:第二天吸棄Matrigel包被培養皿中液體，換新鮮的神經元分化培養基進行培養。本發明將神經祖細胞分化為神經元的細胞模型，其神經元具有人源神經元的形態和特征，此后在該細胞的基礎上建立神經發育毒性的體外測試方法。

技術領域

本發明屬于細胞生物學技術領域，具體涉及一種人神經祖細胞分化方法及其在毒性測試中的應用。

背景技術

化學品安全涉及食品、環境和職業安全等領域，環境化學物污染、職業環境化學物超標、食品安全和環境相關健康問題等已成為目前社會經濟發展的重大問題。傳統化學品安全性評價以動物實驗評價為主，具有花費高、時間長、種屬差異以及動物福利等問題。動物替代試驗方法應用是目前國際上化學品安全性評價的一種趨勢和策略，可以減少實驗動物使用、降低花費、縮短時間和提高評價效率等。目前已經有多個國家包括歐盟、美國、日本和中國等建立各自的替代實驗方法研究中心。已有大量的替代方法經過開發驗證，極大的減少了動物的使用和評價速度。

神經發育毒性評價由于其復雜性和特殊性，目前尚未有好的替代方法進行評價。傳統的神經發育毒性需要涉及大量動物的使用，需要花費大量的成本和時間。美國環境保護署(OPPTS 870.630)和經濟合作與發展組織(OECD TG 426)均有發布DNT研究指南，并且由美國環保署和加拿大衛生部聯合開發殺蟲劑登記系統中對DNT數據如何解釋編寫了相關指南，但目前在美國、歐盟或是其他地區并沒有進行常規DNT測試。除非在成年嚙齒類動物觀察到化學物的神經毒性或內分泌影響，否則法律不要求進行DNT檢測。與此同時成熟大腦中不存在某些神經發育過程，因此會錯失很多導致DNT的有害物質。這些都是解釋到目前為止為什么只有少數環境物質(總共12種)被歸類為人類發育神經毒物。因此迫切需要開發一種快速、成本效益高的標準化DNT替代方法。因此迫切需要開發一種快速、成本效益高的標準化DNT替代方法。

在過去的15年中，人們一直在努力建立、科學驗證和建立DNT體外評價的試驗方法，已經取得了階段性進展。人源干細胞如胚胎干細胞、多能干細胞、誘導多能干細胞、神經祖細胞等由于具有分化成為各種類型神經細胞的潛能，具有開發高通量檢測的潛能且不存在物種之間外推的問題，因此被認為是開發DNT體外測試方法的首選細胞模型。目前研究者根據神經發育的各個階段，采用不同發育階段的人源干細胞模型建立一系列體外測試方法，然而到目前為止，尚未有一種標準的可用于神經發育毒性評價的細胞模型。

發明內容

本發明旨在克服背景技術中的問題，提供一種人神經祖細胞分化方法及其在毒性測試中的應用，神經祖細胞分化為神經元的細胞模型，其神經元具有人源神經元的形態和特征，并可以將該細胞應用于神經發育毒性的體外檢測。

為達到上述目的，本發明采用如下技術方案：一種人神經祖細胞分化方法，包括如下步驟：

S1:使用預冷槍頭將Matrigel吸取，加入至預冷的Advanced DMEM/F12培養基稀釋，制成Matrigel包被液，并將Matrigel包被液預冷；

S2:將預冷Matrigel包被液轉移至培養皿中，并放置于培養箱中靜置，得Matrigel包被培養皿；

S3:將融合度達到70-80％的hNPC細胞，使用PBS洗滌，再使用Accutase消化酶進行消化，之后采用PBS沖洗轉入離心管中；