[發明專利]一種人神經祖細胞分化方法及其在毒性測試中的應用

在審

• 申請號: 202210018602.4
• 申請日: 2022-01-08
• 公開（公告）號: CN114292815A
• 公開（公告）日: 2022-04-08
• 發明（設計）人: 章征保;楊穎;李慶;黃志彪;羅振奎;陳美芬;張秋歡;梁揚盛;彭寶瑩
• 申請（專利權）人: 廣東省疾病預防控制中心
• 主分類號: C12N5/0793
• 分類號: C12N5/0793;C12N5/0797;C12Q1/02
• 代理公司: 重慶以知共創專利代理事務所(普通合伙) 50226
• 代理人: 高建華

1.一種人神經祖細胞分化方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1:使用預冷槍頭將Matrigel吸取，加入至預冷的Advanced DMEM/F12培養基稀釋，制成Matrigel包被液，并將Matrigel包被液預冷；

S2:將預冷Matrigel包被液轉移至培養皿中，并放置于培養箱中靜置，得Matrigel包被培養皿；

S3:將融合度達到70-80％的hNPC細胞，使用PBS洗滌，再使用Accutase消化酶進行消化，之后采用PBS沖洗轉入離心管中；

S4:將離心管中的細胞離心去上清，采用NPC維持培養基并加入ROCK inhibitor重懸細胞后，接種于Matrigel包被培養皿中進行培養；

S5:第二天吸棄Matrigel包被培養皿中液體，換新鮮的神經元分化培養基進行培養，每兩天換液一次，培養至第七天出現神經元特征。

2.如權利要求1所述的人神經祖細胞分化方法，其特征在于，NPC維持培養基的制備方法如下：

步驟一：將Advanced DMEM/F12培養基與Neurobasal培養基按照體積比為1:1進行混合，得混合培養基；

步驟二：向混合培養基內添加1％的胎牛血清、0.4μg/mL皮質醇、B27添加劑、20ng/mL表皮生長因子、20ng/mL成纖維生長因子、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素，制得成品。

3.如權利要求2所述的人神經祖細胞分化方法，其特征在于，神經元分化培養基的制備方法如下：

步驟A、Advanced DMEM/F12培養基與Neurobasal培養基按照體積比為1:1進行混合，得混合培養物；

步驟B、向混合培養物內添加2％的胎牛血清、B27 plus添加劑，40ng/mL成纖維生長因子、2mmol/L谷胱甘肽、200μmol/L維生素C、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉，制得成品。

4.如權利要求3所述的人神經祖細胞分化方法，其特征在于，S1中，Matrigel與Advanced DMEM/F12培養基的體積比為1:100。

5.如權利要求4所述的人神經祖細胞分化方法，其特征在于，S2中，培養箱內的培養條件是37℃、5％CO₂。

6.如權利要求5所述的人神經祖細胞分化方法，其特征在于，S3中，PBS和Accutase消化酶使用前預溫，預溫的溫度為37℃，并且時間不超過10分鐘。

7.如權利要求6所述的人神經祖細胞分化方法，其特征在于，S3中，PBS洗滌細胞的次數為1次，Accutase分散酶消化的時間不超過5分鐘，消化溫度為37℃。

8.如權利要求7所述的人神經祖細胞分化方法，其特征在于，S4中，離心條件為1200轉4分鐘，ROCK inhibitor加入終濃度為5μmol/L。

9.一種神經祖細胞分化為神經元細胞的應用，其特征在于，將權利要求1至8獲得的神經元細胞應用于神經發育毒性檢測。

10.如權利要求9所述的應用，其特征在于，包括如下步驟：

步驟1、使用加入ROCKinhibitor的NPC維持培養基重懸，接種于Matrigel包被液包被好的96孔板中，放入培養箱中培養；

步驟2、第二天換液，將化學品溶于神經元分化培養基中，用于換液處理96孔板細胞48小時，每隔48小時換新鮮配置的化學品用于換液，處理至第7天；

步驟3、加入CCK8孵育，孵育時間為30分鐘到1個小時；

步驟4、用酶標儀測定在450nm處的吸光度。

11.如權利要求10所述的應用，其特征在于，步驟1中，hNPC細胞接種密度為8000個細胞/孔，ROCK inhibitor加入終濃度為5μmol/L，96孔板中每孔加入100μlMatrigel包被液，培養箱培養條件為37℃、5％CO₂。